土壤中存在大量的微生物,每克土壤中含有数百万细菌、几十万真菌孢子和数万原生动物及藻类[1]。土壤微生物可以敏感地反映气候以及土壤微生态环境的变化,所以,土壤微生物种群能较好地指示土壤中有机物质的动态变化[2]。土壤的理化环境和养分含量变化影响着土壤肥力以及与生态系统活动相关的微生物群落结构和功能[3,4,5,6]。土壤中的微生物群落结构一定程度上决定着土壤中营养物质的循环、分解和能量流动,土壤环境的改变能够在很大程度上影响微生物的种群组成和多样性以及土壤生态系统功能。不同植被群落所生长的土壤环境具有一定的差异性,土壤中的微生物群落结构状态也存在差异。有研究指出,寒温带地区,针阔叶混交林土壤微生物多样性指数最高,灌丛最低[7];暖温带地区,针叶林与阔叶林各自的土壤微生物的优势菌属差异较大,阔叶林的土壤微生物多样性大于针叶林[8]。北京市松山国家级自然保护区位于暖温带区域,植被类型多样,森林、灌丛和草甸类型齐全,已有研究表明保护区内的蒙古栎阔叶林土壤真菌菌落数量高于天然油松林土壤[9],但不同植被类型下土壤微生物的群落结构仍不清楚。因此,该研究以北京市松山国家级自然保护区内的不同植被群落土壤(乔木、灌丛和草甸)为研究对象,基于样地调查和土壤样品的采集和分析,比较不同植被类型间土壤微生物群落(细菌和真菌)结构的差异并揭示影响因素,为松山国家级自然保护区的土壤微生物资源利用和保护提供参考依据。

1、材料与方法

1.1试验区概况

试验区位于北京市松山国家级自然保护区内,东经115°43′44″～115°50′22″,北纬40°29′9″～40°33′35″,地处北京市延庆县海坨山南麓[10]。属暖温带大陆性季风气候,年均温8.5℃,年降水量与蒸发量分别为493.0mm和1772.0mm,年平均日照时数2836.3h[10]。保护区地势北高南低,平均海拔627.6～2198.4m[11]。该区土壤类型以山地褐土、棕色森林土和山地草甸土为主[12]。典型植被类型包括以胡桃楸(Juglansmandshurica)和蒙古栎(QuercusmongolicaFisch.exLedeb)为主的阔叶林;以油松(PinustabuliformisCarr.)和侧柏(Platycladusorientalis(L.)Franco)为优势种的针叶林;以红丁香(SyringavillosaVahl)和小花溲疏(DeutziaparvifloraBge.)为主的灌丛和以披针叶薹草(CarexlanceolataBoott)和地榆(SanguisorbaofficinalisL.)为优势种的草甸[13,14]。

1.2试验材料

供试土样于2019年7月取自北京市松山国家级自然保护区内6种典型植被样地,分别为胡桃楸阔叶林(JMB)、蒙古栎阔叶林(QMB)、油松针叶林(PTC)、针阔叶混交林(MBC)、灌丛(BW)和草甸(MD)样地0～30cm土层土壤。

1.3试验方法

在每个样地中分别设置4个20m×20m的样方,测定海拔、土壤含水量、总孔隙度和土壤温度。在每个样方的4个角分别取0～5cm土层土壤,同一样地同一土层样品组合成一个混合土样,挑出土样中的石块和残根等,将混合好的样品过2mm筛后,置于-80℃冰箱保存,带回实验室用于pH及土壤微生物测定。经野外及实验室测定可知,灌丛的海拔高度最高,为2100m,蒙古栎阔叶林海拔为792m,最低的为胡桃楸阔叶林样地,仅有700m。灌丛、胡桃楸阔叶林、蒙古栎阔叶林表层土壤含水量分别为69.90%、43.23%和27.81%,总孔隙度分别为65.8%、63.0%和47.4%,土壤温度分别为11.9、15.9℃和17.1℃。灌丛样地的pH最高为6.8,胡桃楸阔叶林和蒙古栎阔叶林样地的pH为6.7。

1.4项目测定

1.4.1高通量测序

采用PowerSoil试剂盒(MoBioInc.,USA)提取土壤DNA,称取0～5cm土层土壤样品0.3～0.5g,利用微生物通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)与806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),528F(5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′)与706R(5′-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′)扩增其V4区基因片段,PCR扩增反应条件为95℃预变性5min;94℃变性45s;56℃退火45s;72℃延伸45s;以上过程进行30个循环;后72℃延伸10min。每个样品重复扩增3次。PCR扩增以后,3管同一样品合并,用GeneJET试剂盒(ThermoScientificInc.,USA)纯化,用NanoDrop2000(ThermoScientificInc.,USA)测定PCR产物浓度[15],所得样品由北京诺禾致源测序公司进行高通量测序。

1.4.2土壤微生物信息与Alpha多样性分析

在对序列进行分析时,去除不含样品信息的序列,并进行分类操作单元(OperationalTaxonomicUnits,OTUs)分析。通过归类操作,将序列相似性达到97%的归为一个OTUs,使用最大似然法聚类分析OTUs,并进行微生物相对丰度分析[16]。

Alpha多样性为通过香农指数(Shannonindex)、辛普森指数(Simpsonindex)和Ace指数来评估单样本内微生物群落的丰富度和多样性差异[17]。计算公式为:

公式1

公式2

公式3

式中:Pi是第i种个体数ni占个体总数N的比例,S为物种数目,N为所有物种的总个体数,ni是第i种的个体数。

1.5数据分析

采用R软件制作OTUs土壤细菌和真菌的花瓣图和真菌相对丰度图。采用Origin2018软件对各因素进行主成分分析。

2、结果与分析

2.1土壤微生物OTUs分析

6种典型植被中,土壤细菌所共有的OTUs序列为1427个,其中胡桃楸阔叶林(JMB)中特有的OTUs最高,为174个;灌丛(BW)中特有的OTUs次之,为134个;针阔叶混交林(MBC)特有的OTUs最低,为76个(图1A)。真菌共有的OTUs序列为247个,胡桃楸阔叶林中特有的OTUs最高,为965个,其次为针阔叶混交林中特有的OTUs,为604个,灌丛中特有的OTUs最低,为230个(图1B)。由此可见,在6种典型植被中,胡桃楸阔叶林土壤细菌和真菌特有的OTUs最高,细菌和真菌的OTUs最低值则分别在针阔叶混交林和灌丛样地中。

图1不同样地土壤细菌和真菌OTUs图

2.2土壤微生物Alpha多样性分析

胡桃楸阔叶林中细菌和真菌的香农指数、辛普森指数和Ace指数均最高,分别为9.67和7.80、0.99和0.98以及2502.76和1581.28;针阔叶混交林中香农指数、辛普森指数和Ace指数仅次于胡桃楸阔叶林,分别为9.38和7.01、0.99和0.96以及2394.76和1315.77;蒙古栎阔叶林的细菌香农指数、辛普森指数和Ace指数为最低,分别为7.84,0.96和1784.49,真菌的香农指数、辛普森指数和Ace指数最低值分别出现在灌丛和油松针叶林样地中,分别为4.96、0.78和1010.24(表1)。在6种典型植被中,胡桃楸阔叶林土壤细菌和真菌Alpha多样性最高,细菌和真菌的Alpha多样性最低值则分别在蒙古栎阔叶林和灌丛样地中。在整体水平上细菌多样性要高于真菌。

表1不同样地真菌和细菌的Alpha多样性

图2不同样地细菌物种相对丰度

2.3土壤微生物相对丰度分析

各植被群落土壤中前10种细菌的优势菌门依次为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、奇古菌门(Thaumarchaeota)和罗卡氏菌(Rokubacteria)。其中变形菌门在各植被类型样地中的相对丰度最高,丰度值范围介于0.33～0.44。放线菌门的相对丰度次之,丰度值范围介于0.19～0.39,在蒙古栎阔叶林土壤中的含量高于其它样地。罗卡氏菌(Rokubacteria)丰度最低,丰度值介于0.003～0.010,其它细菌群落的丰度值范围均在0.10以下(图2)。由此可见,6种植被类型下土壤中细菌以变形菌门、放线菌门和酸杆菌门为主。

各群落土壤中前10种真菌优势菌门,依次为:担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、被孢菌门(Mortierellomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、毛霉菌门(Mucoromycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、毛微亚界的Calcarisporiellomycota和单毛壶菌门(Monoblepharomycota)。担子菌门在蒙古栎阔叶林样地中达到最高,为0.67,其次在灌丛样地,为0.33,在其余4个样地中所占比值为0.08～0.12。子囊菌门相对丰度除蒙古栎阔叶林外,在其它样地中均最高,丰度值介于0.31～0.42(图3)。由此可见,6种植被类型下土壤中真菌主要为担子菌门和子囊菌门。

图3不同样地真菌物种相对丰度

2.4典型植被群落土壤微生物群落特征与土壤理化性质及环境因子的关系

利用Origin2018软件对细菌和真菌的丰富度和多样性、土壤理化性质和环境因素等15项指标进行主成分分析后得出,前3个主成分的贡献率分别为39.92%、26.11%和16.57%,累积贡献率达到82.60%,说明前3个主成分可以反应基础数据的信息。因此,选取前3个主成分评价各指标间的关系(表2)。主成分分析表明,真菌多样性、土壤温度、容重以及pH与第1主成分的夹角较小,说明第1主成分主要反映真菌多样性与土壤温度、容重和pH的变化情况,但真菌多样性与总孔隙度、含水量和海拔之间呈钝角,说明总孔隙度、含水量和海拔的变化对真菌多样性存在负效应(图4)。细菌多样性与第2主成分所夹角度均较小,说明其主要反映细菌多样性的变化情况,其与土壤含水量、总孔隙度和pH之间的夹角均较小,说明土壤理化性质与细菌多样性之间存在影响关系。第3主成分则主要反映了细菌和真菌丰富度、土壤容重和植被类型之间的关系(图4)。

图4土壤微生物指标与土壤理化性质及环境因子的主成分分析

表2主成分特征值、方差贡献率和累计方差贡献率

3、讨论与结论

土壤微生物的群落结构主要受土壤温度及水分的影响,且2个因素常表现出协同效应[18]。该研究中胡桃楸阔叶林的细菌和真菌的OTUs和多样性均最高,该研究结果与前人研究结果相似[19]。由于胡桃楸阔叶林所处海拔和土壤含水量均较低,土壤温度较高,有利于促进植物代谢和分泌物增加,为微生物生长提供所需的养分,促进微生物的生长和繁殖,提高土壤微生物的OTUs和多样性;真菌的OTUs和多样性最低值均出现在灌丛群落,该研究结果与其他学者的研究结果相似[20]。因为灌丛土壤温度较低,海拔和土壤含水量较高,导致植物为微生物提供生长动力的能力下降,不利于微生物的生长和繁殖,而且通气较差的土壤环境会抑制真菌的繁殖和生长,因此,该群落土壤中真菌的OTUs和多样性较低。

土壤中的细菌丰度较高,不同环境和不同类型的土壤中既有相似的细菌组成,同时又有各自的优势类群[21]。该研究中各植被群落土壤中细菌的优势菌门类型主要为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门,该研究结果与前人所得一致[5,22,23]。这是由于变形菌门、放线菌门和酸杆菌门具有较宽的生态位,而且对不同植被群落下土壤的水热条件和理化环境具有较强的适应性,所以3种细菌菌门的相对丰度较高。

土壤真菌参与有机质的分解,在生物地球化学循环中具有重要的功能[24]。各植被群落中的真菌群落主要以担子菌门和子囊菌门为主,有研究表明担子菌门和子囊菌门偏好通气较好的土壤条件,均是陆生的高等菌物,是土壤中主要的真菌分解者[25,26]。该研究中,蒙古栎阔叶林担子菌门丰度最高,这与尚蓓[9]研究结果相似,因为该群落土壤温度和总孔隙度较高,土壤含水量较低,通气性良好,且土壤pH较低,有利于提高担子菌门的丰度。子囊菌门是土壤中的关键分解群落,能够降解木质素等难降解物质,除蒙古栎阔叶林样地外,在各群落土壤中所占比重均较高,这说明子囊菌门能够适应不同土壤环境[27]。

土壤pH、含水量和土壤温度会影响细菌和真菌的丰富度与多样性。6种典型植被类型中,胡桃楸阔叶林土壤细菌和真菌特有的OTUs和Alpha多样性均最高,细菌和真菌OTUs最低值则分别出现在针阔叶混交林和灌丛,Alpha多样性最低值出现在蒙古栎阔叶林。

各样地中的细菌与真菌的群落组成基本相似,细菌群落主要为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门等,真菌群落以担子菌门和子囊菌门等为主。

参考文献：

[1]蔡燕飞,廖宗文.土壤微生物生态学研究方法进展[J].土壤与环境,2002,11(2):167-171.

[2]吴求生,龙健,李娟,等.茂兰喀斯特森林小生境类型对土壤微生物群落组成的影响[J].生态学报,2019,39(3):256-265.

[7]曹宏杰,王立民,徐明怡,等.五大连池新期火山熔岩台地不同植被类型土壤微生物群落功能多样性[J].生态学报,2019(21):1-11.

[8]张克弟,巨天珍,王继伟,等.暖温带针阔叶林下土壤微生物区系群落特征及其动态研究[J].微生物学杂志,2016,36(3):7-13.

[9]尚蓓.松山林区木腐菌与两类主要林型土壤真菌的研究[D].北京:北京林业大学,2008.

[10]赵娜,鲁绍伟,李少宁,等.北京松山自然保护区典型植物群落物种多样性研究[J].西北植物学报,2018,38(11):2120-2128.

[11]黄萍,刘艳红.北京松山油松林林分结构和地形对幼苗更新的影响[J].生态学杂志,2018,37(4):1003-1009.

[12]高杰,郭子健,刘艳红.北京松山天然油松林土壤有机碳分布及其影响因素[J].生态学杂志,2016,35(10):2707-2713.

[13]沐先运,何理,吴记贵,等.北京松山国家级自然保护区野生种子植物分布及物种组成分析[J].植物资源与环境学报,2014,23(3):94-101.

[14]苏日古嘎,张金屯,王永霞.北京松山自然保护区森林群落物种多样性及其神经网络预测[J].生态学报,2013,33(11):3394-3403.

[15]王磊,赵霞,王文静,等.诱导耐药沙门菌CRISPR检测及cas基因表达分析[J].南京农业大学学报,2018,41(2):370-376.

[16]顾磊,许科伟,汤玉平,等.基于高通量测序技术研究玉北油田上方微生物多样性[J].应用与环境生物学报,2017,23(2):276-282.

[19]张萌萌,张钰莹,吴迪,等.人工针阔混交林土壤微生物群落碳代谢特征[J].东北林业大学学报,2018,46(12):76-81.

[20]李雪梦,姚庆智,崔丽,等.阴山山脉典型森林植被土壤酶活性与微生物数量的研究[J].干旱区资源与环境,2019,33(10):150-155.

[27]李鹏.小蓬竹根际土壤可培养微生物及其酶活性研究[D].贵阳:贵州大学,2015.

范雅倩,安菁,梁晨.北京市松山国家级自然保护区典型植被群落的土壤微生物群落结构特征[J].北方园艺,2021(01):81-86.

基金:北京松山国家级自然保护区2019年综合管护资助项目