银杏(GinkgobilobaL.)具有极高的经济、生态、观赏和科学研究价值,它是世界上最古老的孑遗树种之一,具有“活化石”之称[1]。银杏叶中黄酮对心血管系统的疾病有特殊疗效[2],且药副作用小,银杏叶制剂在国内外市场供不应求[3],提高银杏叶黄酮含量成为研究热点[4]。

微量元素硒(Se)对植物本身是一种有益元素,可以增强植物的抗氧化能力,有助于植物生长发育和次生代谢产物积累[5]。硒按形态可分为物理形态和化学形态,物理形态包含纳米硒;化学形态分无机硒和有机硒[6]。纳米硒是一种纳米级的单质粒子[7],稳定、具有较高生物活性[8],同浓度下与无机硒例如亚硒酸盐相比,纳米硒的毒性较小[9];生物有机硒或纳米硒主要靠植物或微生物转化而来[10],绿色安全[11]。研究表明,纳米硒比无机硒或有机硒更能被生物有效利用[12,13]。

近年来使用纳米硒处理的植物有黄芪[14]、小麦和水稻[15]等,产量和品质均有提升,但鲜见用纳米硒处理银杏的研究。鉴于此,该研究以银杏叶为试验材料,探究不同浓度的生物纳米硒,对银杏叶生理指标和黄酮含量的影响,以期为银杏栽培、高效利用生物纳米硒提供参考依据。

1、材料与方法

1.1试验材料

供试银杏品种为“家佛手”,种植于武汉轻工大学苗圃大棚中的塑料花盆中,每盆均匀定植1株,采用盆栽土壤栽培。试验材料为银杏的叶片。

生物纳米硒由湖北省农业科学院富硒研究团队提供,其由一种枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisSE201412)从无机硒转化而来,经检测,纳米硒粒径为40～270nm。试验期间,对各个植株进行正常栽培措施管理。

1.2试验方法

试验设置对照组CK(蒸馏水),生物纳米硒溶液设置0.4、0.8、1.6、3.2mmol·L-1共4个试验组。对照组和每个试验组均是15棵盆栽苗。所有处理均设置3个生物学重复,均是3次喷施处理,处理时间分别为5月31日、7月15日、8月15日。采样时间为6月14日、7月14日、8月14日、9月14日、10月14日。

1.3项目测定

叶绿素、类胡萝卜素含量测定采用乙醇浸提法[16],可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[16],可溶性糖、淀粉含量测定采用硫酸-蒽酮法[17]。银杏叶黄酮含量测定采用任红等[18]的方法,包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、总黄酮醇苷。所有指标测定均采用银杏叶片,重复3次。

1.4数据分析

采用MicrosoftExcel2010和Origin9.1软件进行数据处理和作图,采用DPS7.05软件中的Duncan新复极差法进行不同处理间均值的显著性差异比较,结果为平均值±标准差,以P<0.05为显著性水平。利用SPSS19.0软件中的Spearman方法做相关性分析。

2、结果与分析

2.1不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中叶绿素含量的影响

从图1可以看出,不同纳米硒处理组,在不同时间对银杏叶片的叶绿素含量影响不同。在6月,0.4mmol·L-1的纳米硒可显著提高银杏叶绿素含量,比对照组(CK)提高13.53%;其它浓度组均无显著差异。在7月,1.6mmol·L-1的纳米硒可显著提高银杏叶绿素含量,比CK提高43.87%;其它浓度组均无显著差异。在8月,0.4mmol·L-1的纳米硒可显著提高银杏叶绿素含量,比CK提高25.57%;其它浓度组均无显著差异。在9月,与CK相比,0.4、0.8、1.6mmol·L-1的纳米硒分别显著提高16.87%、27.71%、13.86%。在10月,与CK相比,0.4、0.8mmol·L-1的纳米硒分别显著提高30.69%、35.64%。从试验结果来看,0.4、0.8、1.6mmol·L-1的纳米硒可在不同月份显著提升银杏叶绿素含量;3.2mmol·L-1的纳米硒处理组在各月份对银杏均不能显著提升叶绿素含量。纵观整个时期的1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组,与6月相比,7月提升差异显著,高出6月60.42%。

图1生物纳米硒对银杏叶叶绿素含量的影响

2.2不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中类胡萝卜素含量的影响

由图2可知,不同纳米硒处理组,在不同时间对银杏叶片的类胡萝卜素含量影响不同。在6月,0.4mmol·L-1的纳米硒可显著提高银杏中类胡萝卜素含量,比对照组提高14.91%,其它浓度影响不显著。在7月,1.6mmol·L-1的生物纳米硒显著提高类胡萝卜素含量,相比对照组提高了30.30%;其它浓度影响不显著。在8月,0.4mmol·L-1的生物纳米硒处理组,相比对照组,显著提高了20.91%;其它浓度组影响不显著。在9月,0.8mmol·L-1生物纳米硒处理组,相比对照组,显著提高了17.74%;其它浓度影响不显著。在10月,所有处理组均对类胡萝卜素无明显促进作用。

纵观整个采叶期1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组,类胡萝卜素含量排序为7月>9月>6月>8月>10月,7月分别高出6月、8月、10月28.75%、44.56%、69.31%,差异显著。

图2生物纳米硒对类胡萝卜素含量的影响

2.3不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中可溶性蛋白质含量的影响

图3生物纳米硒对银杏叶可溶性蛋白质含量的影响

由图3可知,银杏叶片内可溶性蛋白质在生长季节内呈现逐渐升高的变化。6月时,0.4、0.8mmol·L-1的纳米硒处理组分别高于CK16.64%、14.87%,但不具显著性差异。7月时,0.8mmol·L-1的纳米硒处理组显著优于CK,高出25.48%;其它组别无显著性差异。8月中,0.4、0.8、1.6、3.2mmol·L-1纳米硒处理组分别高于CK29.29%、55.47%、70.68%、60.40%,差异显著。9月,0.8、1.6mmol·L-1处理组分别高于CK35.84%、56.18%。10月,1.6mmol·L-1纳米硒处理组最高,比CK高出35.90%。从试验处理来看,1.6mmol·L-1的纳米硒处理组在8—10月均显著提高银杏叶可溶性蛋白质含量;0.8mmol·L-1的纳米硒处理组次之;0.4mmol·L-1的纳米硒处理组有较少的促进作用;3.2mmol·L-1的纳米硒处理组在9—10月对银杏叶可溶性蛋白质有显著的抑制作用。

纵观整个时期1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组的蛋白质含量,与6月相比,7—10月分别高出53.43%、113.65%、192.01%、316.10%,6月与9—10月有显著差异。

图4生物纳米硒对银杏叶可溶性糖含量的影响

2.4不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中可溶性糖含量的影响

从图4可以看出,不同月份银杏叶片中的可溶性糖含量存在差异。6月,3.2mmol·L-1纳米硒处理组高于CK33.52%。7月,0.4、0.8、1.6、3.2mmol·L-1纳米硒处理组分别高于CK31.54%、34.56%、59.92%、67.12%,差异显著。8月,0.8mmol·L-1纳米硒与CK相比有显著提高,高出25.92%。9月0.4、0.8、1.6mmol·L-1纳米硒与CK相比能显著提高可溶性糖含量,分别高出20.91%、14.89%、18.60%。10月所有浓度对可溶性糖的影响较小。

纵观整个时期1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组的可溶性糖含量,7、9、10月分别高出6月4.17%、22.95%、2.84%,9月有显著差异。综上所述,8月0.8mmol·L-1纳米硒对可溶性糖的提高作用最大。

2.5不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中淀粉含量的影响

由图5可知,银杏叶片内淀粉含量随着月份变化,CK变化不大,而不同浓度纳米硒处理后对其有较大影响。6月中,0.4、1.6mmol·L-1处理组分别高于CK29.81%、29.95%。7—8月,0.8mmol·L-1纳米硒处理组最高,与CK相比分别提高了80.41%和29.09%,差异显著。9—10月,0.4mmol·L-1纳米硒处理组最高,与CK相比分别提高了38.26%和31.27%。从试验结果来看,0.4、0.8mmol·L-1纳米硒处理组可在一定程度上提高银杏叶淀粉含量。

图5生物纳米硒对银杏叶淀粉含量的影响

2.6不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中黄酮含量的影响

2.6.1不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中槲皮素含量的影响

由图6可知,不同月份不同处理下,银杏叶片中的槲皮素含量存在差异。7—9月,1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组的槲皮素含量分别显著高出CK42.47%、14.96%、9.23%,差异显著,3.2mmol·L-1生物纳米硒处理组只在7月有显著提高,比CK高36.88%,0.8mmol·L-1处理组仅在9月有显著提高,比CK高18.33%。10月,各处理组的槲皮素含量均低于CK,差异显著。

由此可得,对于提升银杏叶槲皮素含量,生物纳米硒在1.6mmol·L-1浓度下最佳。7月采样可获得槲皮素含量较高的银杏叶。

图6生物纳米硒对银杏叶槲皮素含量的影响

2.6.2不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中山奈酚含量的影响

从图7可以看出,1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组银杏叶的山奈酚,在6、7、9月分别高出CK10.13%、39.57%、52.08%,差异显著。0.8mmol·L-1生物纳米硒处理组银杏叶的山奈酚,在7—9月分别高出CK17.01%、18.04%、40.33%,差异显著。0.4、3.2mmol·L-1生物纳米硒处理组,在9月分别高出CK22.40%、22.87%,差异显著。

从9月来看,1.6mmol·L-1处理组的山奈酚含量分别高于0.8、3.2、0.4mmol·L-1处理组8.37%、23.77%、24.25%,差异显著。因此,对于提升银杏叶山奈酚含量,生物纳米硒在1.6mmol·L-1浓度下最佳。9月采样可获得槲皮素含量较高的银杏叶。

图7生物纳米硒对银杏叶山奈酚含量的影响

2.6.3不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中异鼠李素含量的影响

由图8可知,0.4mmol·L-1生物纳米硒处理组在7—10月分别高出CK51.20%、9.58%、49.70%、43.02%,差异显著;0.8mmol·L-1生物纳米硒处理组在7—10月分别高出CK76.80%、9.58%、75.15%、21.51%,差异显著;1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组在6—10月分别高出CK16.67%、97.60%、12.57%、58.79%、15.70%,差异显著。3.2mmol·L-1生物纳米硒处理组在6、7、9月分别高出CK20.83%、91.20%、62.42%,差异显著。由此可得,该试验中的所有生物纳米硒处理组均能在7月和9月显著提高银杏叶异鼠李素的含量。

图8生物纳米硒对银杏叶异鼠李素含量的影响

2.6.4不同浓度纳米硒处理对银杏叶片中总黄酮醇苷含量的影响

由图9可知,不同月份、不同浓度纳米硒肥对银杏叶片总黄酮醇苷含量的影响不同。0.4mmol·L-1处理总黄酮醇苷含量,仅在9月有显著提高,比CK高出14.01%。0.8mmol·L-1的纳米硒处理总黄酮醇苷含量,在7—9月,分别比CK高出19.26%、7.84%、33.72%,差异显著。1.6mmol·L-1的纳米硒处理,在6—9月,总黄酮醇苷分别比CK高出8.47%、43.99%、11.17%、35.04%,差异显著。3.2mmol·L-1的纳米硒处理,在6—9月,总黄酮醇苷分别比CK高出10.73%、23.47%、8.85%、18.18%。

图9生物纳米硒对银杏总黄酮醇苷含量的影响

在7月,1.6mmol·L-1处理组的总黄酮醇苷含量分别高于0.4、0.8、3.2mmol·L-1处理组46.55%、20.73%、16.62%,差异显著。在9月,1.6mmol·L-1处理组的总黄酮醇苷含量分别高于0.4、3.2mmol·L-1处理组18.45%、14.27%,差异显著。

从试验结果来看,处理组的生物纳米硒均可在9月显著提高银杏叶总黄酮醇苷的含量,其中,1.6mmol·L-1的纳米硒处理组在6—9月均表现良好。纵观整个时期1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组的总黄酮醇苷,与8月相比,6、7、9、10月的总黄酮醇苷分别高出6.78%、31.84%、36.70%、9.78%。其中,7、9月差异显著。因此,在7月和9月采收可获得含总黄酮醇苷较高的银杏叶。在7—10月的各个月份里,总黄酮醇苷的含量随着生物纳米硒浓度加大,呈现先增高后降低的趋势。

2.7纳米硒处理组银杏叶片生理指标和黄酮含量的相关性

从表1可以看出,对于生物纳米硒处理组的银杏叶片,叶绿素和类胡萝卜素呈极显著正相关,表明色素合成代谢过程时,它们有良好的协调作用,与程水源等[19]研究一致;叶绿素与可溶性蛋白质呈极显著负相关;叶绿素与淀粉含量呈极显著正相关;可溶性蛋白质和可溶性糖呈显著正相关;可溶性蛋白质与淀粉呈极显著负相关;可溶性蛋白质和可溶性糖与总黄酮醇苷含量均呈极显著正相关。

表1纳米硒处理组银杏叶生理指标与黄酮相关性

3、讨论与结论

3.1一定浓度的生物纳米硒可以促进银杏叶光合作用及初生代谢物和黄酮的形成

在适宜的浓度范围内,无机硒可以调节植物体内卟啉的合成,促进植株对叶绿素合成相关矿质元素(如P、K、Ca、Mg等)的吸收,提高叶绿素含量,并调节光合作用[20]。陈军等[21]对银杏施加无机硒,可显著提高银杏的叶绿素、可溶性糖、黄酮含量。但由于同浓度下无机硒的毒性高于生物纳米硒,更容易对植物造成迫害作用而抑制其生长[22],DOMOKOS-SZABOLCSY等[23]用硒酸盐和纳米硒培养烟草愈伤组织时,265～530μmol·L-1的纳米硒能显著刺激根的生长,但同浓度下的无机硒完全抑制了愈伤组织的生长。而且,即使是低浓度的无机硒,处理地理范围广,也容易造成环境污染,会影响人体健康,农业生产力以及自然生态系统的稳定性[24],因此不推荐使用。

胡万行等[25]用15mg·kg-1生态纳米硒溶液喷施马铃薯叶面后,发现叶绿素含量有显著提升,马铃薯的光合作用和生长发育得到促进。在该试验中,以9月为例,生物纳米硒浓度在0.8mmol·L-1和1.6mmol·L-1时,各处理可以显著提高银杏叶绿素、可溶性蛋白质、可溶性糖、淀粉的含量,这些物质的增加属于初生代谢产物的积累过程,为黄酮类化合物次生代谢合成提供前提。因此在该试验中,0.8、1.6mmol·L-1生物纳米硒处理组的槲皮素、山奈酚、异鼠李素以及总黄酮醇苷的含量在9月均有显著提高。该试验与适宜浓度的纳米硒可以促使黄芪[14]、小麦和水稻[15]、柑橘[26]产量增加、猕猴桃[27]品质更好等研究一致。由此可得,一定浓度的生物纳米硒也可像合适浓度的无机硒一样,促进银杏光合作用以及初生代谢物和黄酮的形成。

由相关性分析可知,生物纳米硒通过提升植物初生代谢产物例如可溶性糖、可溶性蛋白质的积累,从而进一步提升银杏黄酮的含量。可溶性蛋白质与黄酮之间呈显著正相关,说明了它们之间由于竞争同一底物而表现为相互促进关系,即通过竞争,促进光合产物的转化,表现为二者含量的提高,这与程水源等[28]研究一致。

王佑成等[29]用不同浓度纳米硒处理绿豆芽,低浓度(0.06～0.38mmol·L-1)有显著促进生长作用,高浓度(0.57mmol·L-1)处理后有显著抑制生长作用。该试验与之不同,在9月,与CK相比,3.2mmol·L-1处理组对银杏叶内山奈酚、异鼠李素、总黄酮醇苷有显著提升作用,对叶绿素、可溶性糖、淀粉、槲皮素含量的影响并无显著差异,仅仅对可溶性蛋白质有显著抑制作用,而这说明3.2mmol·L-1对银杏并非是很高的浓度,可能与银杏有抗胁迫能力,对生物纳米硒具有一定的抗性有关,至于更高浓度的生物纳米硒对银杏生长是否有毒害作用以及对黄酮合成是否有抑制作用有待进一步研究。

7—10月的总黄酮醇苷含量随处理浓度加大有先增后减的趋势,这与刘嘉兴等[30]的研究一致,用分别稀释100、200、400、600、800倍的纳米硒溶液(原浓度1500mg·kg-1)对生菜进行叶面喷施,生菜品质随着硒浓度的降低呈现先增加后降低的趋势。因此,对植物喷洒的硒浓度不能过高,否则对植物生长促进作用不明显,选择合适浓度的生物纳米硒至关重要。

3.2以银杏叶黄酮为标准,生物纳米硒最佳浓度为1.6mmol·L-1，最佳采收时间为7月和9月

比较CK和其它处理组,1.6mmol·L-1处理组中银杏叶叶绿素、可溶性糖和总黄酮醇苷的含量在7月和9月均有大幅提高,分别较CK高出43.87%、59.92%、43.99%和13.86%、18.60%、35.04%,提升差异显著,说明1.6mmol·L-1生物纳米硒可以显著促进银杏叶初生代谢产物的合成,进而促进了黄酮类代谢产物的合成。因此生物纳米硒浓度选用1.6mmol·L-1。

总黄酮醇苷是衡量银杏叶品质的重要指标。在7—9月,相比CK和其它处理组,1.6mmol·L-1纳米硒处理组的总黄酮醇苷含量一直稳居第一,提升效果最好,纵观1.6mmol·L-1纳米硒处理组的总黄酮醇苷含量,与8月相比,6、7、9、10月分别高出6.78%、31.84%、36.70%、9.78%,7、9月差异显著。因此,生物纳米硒处理后最佳叶片采收时间为7月和9月,可获得高黄酮含量的银杏叶。

该研究为银杏栽培、提高银杏叶黄酮类化合物含量、充分利用生物纳米硒提供理论指导和技术支持,还为后续研究银杏叶内有机硒形态以及含量等提供理论基础。

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基金:湖北省“高端人才引领培养计划”资助项目(鄂科技通[2012]86号);国家自然科学基金资助项目(31270717,31400556)