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筛选中华蜜蜂气味受体AcerOr2基因最佳干扰片段情况
摘要：为了筛选出中华蜜蜂气味受体基因AcerOr2最佳干扰效率的序列，以中华蜜蜂气味受体AcerOr2基因为靶标，分别选取3个片段AcerOr2-1(411bp)、AcerOr2-2(205bp)和AcerOr2-3(471bp)，并构建相应的dsRNA表达载体，获取dsRNA后进行RNAi试验，通过qPCR和Western从mRNA水平和蛋白水平检测干扰效率。mRNA结果显示，饲喂3个不同的片段AcerOr2-1(411bp)、AcerOr2-2(205bp)和AcerOr2-3(471bp)对AcerOr2表达量均会产生抑制作用，抑制率分别为69.72%±0.49%、47.26%±0.25%、73.17%±0.97%，抑制率最佳的是471bp的dsRNAAcerOr2-3。WesternBlot结果显示，饲喂3个大小不同的干扰片段后AcerOr2蛋白的表达量均受到显著抑制。试验成功构建AcerOr2基因干扰载体，最终确定471bp的dsRNAAcerOr2-3为最佳干扰片段，证实其能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达。研究结果可为进一步应用RNAi技术研究该基因的体内外功能奠定基础。
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蜜蜂的嗅觉系统是需要多种蛋白分子参与的复杂的化学信号通讯过程，其嗅觉感知起始于表达在嗅觉受体神经元（OSNs）上的特异性气味受体识别并区分周围环境（包括群内及外界环境）中的气味分子，相应的气味分子与其同源的特异性气味受体ORs结合激活信号转导级联反应，打开离子通道，从嗅觉受体神经元向大脑发送电信号，并产生气味相关动作电位。昆虫OR具有与哺乳动物的G蛋白偶联受体截然相反的7个跨膜拓扑结构（即N端位于细胞内，C末端位于细胞外），与哺乳动物气味受体之间无同源性[1,2,3]。在昆虫体内，气味受体主要位于嗅觉神经元树突上[4,5]，参与嗅觉信号识别的初始过程。每个嗅觉神经元表达2类气味受体：高度保守的共受体Orco和传统的气味受体[6,7,8,9]，其中，传统的气味受体在不同昆虫间差异较大，可分为性信息素受体和普通受体[10,11,12]；而Orco在不同昆虫间则高度保守[1,3]，不可以识别气味分子，但能帮助传统的气味受体在树突膜上的折叠和正确定位。
山西农业大学动物科技学院蜜蜂研究课题组在之前的研究中从中华蜜蜂克隆并鉴定出一个共受体基因AcerOr2(GenBank登录号：JN792581），并且发现在工蜂触角发育的各个阶段AcerOr2都有表达[13]，与意大利蜜蜂共受体AmelOr2有类似的表达谱[14]，结果表明，中华蜜蜂共受体AcerOr2可能参与了性别和分工等嗅觉感知过程。蜜蜂的气味受体在其亲属辨认、采集食物、工蜂监督和防御等行为上起着重要的作用[15]，但是与果蝇和蚊子等其他昆虫相比，有关蜜蜂Ors功能的研究相对较少。
本研究通过构建相应的AcerOr2干扰质粒，并筛选出最佳的干扰序列，旨在为将来通过RNAi进一步研究AcerOr2功能的相关机制奠定基础。
1、材料和方法
1.1材料
1.1.1供试蜜蜂
中华蜜蜂饲养于山西农业大学中蜂试验场。取封盖子脾放置于人工气候箱（温度32℃、相对湿度65%±5%），待出房后将蜜蜂放置于饲喂盒（10cm×5cm）中（将培养箱温度调整为28℃，湿度不变）。
1.1.2主要试剂、菌株、质粒
TrizolRReagent、PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKit和SYBRSYBRRPremixExTaqTMIIKit购自TaKaRa公司；JM109、T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem试剂盒、WizardRSVGelandPCRClean-UpSystem试剂盒和pGEMR-TEasy载体购自Promega公司；EcoRI和BamHI购自NEB公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega公司；PlasmidMiniKit购自康为世纪公司；TOP10、昆虫细胞蛋白提取试剂盒购自生工生物工程有限公司；辣根过氧化物酶酶标羊抗兔β-actin、蛋白酶抑制剂PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光底物等购自Boster公司；AcerOr2多克隆抗体购自北京京成天脉公司。
1.2方法
1.2.1AcerOr2基因dsRNA的合成
以NCBI上AcerOr2(JN792581）和GFP(JQ064510.1）基因cD-NA编码区（ORF）为模板，使用PrimerPremier6.0设计目的基因AcerOr2的3个不同片段大小的引物和内参GFP的1个片段引物（表1），并在引物5′端添加T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAGGG）。以克隆测序后确认含有目的基因AcerOr2部分序列的质粒DNA作为模板进行PCR扩增（94℃预变性3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸45s,35个循环；72℃延伸10min）。使用WizardRSVGelandPCRClean-UpSystem试剂盒（Promega）对PCR产物进行纯化，并对纯化后的PCR产物进行定量，使其满足体外合成dsRNA的量。根据T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem试剂盒操作手册，使用T7RNA聚合酶将上述回收的DNA产物体外合成dsRNA，浓度测定后，-80℃保存备用。
表1体外转录的引物设计
1.2.2中华蜜蜂饲喂dsRNA试验
试验设置dsGFP、dsAcerOr2-1、dsAcerOr2-2、dsAcerOr2-3共4个处理组，每组处理重复3次。取新出房后饥饿2d的蜜蜂，每只使用移液枪饲喂10μgdsRNA，后置于恒温箱（温度28℃，相对湿度65%）中饲养。每天更换新鲜饲料并采集样品。
1.2.3RNA干扰效果检测
1.2.3.1qPCR检测干扰效果
采集饲喂dsRNA后4日龄的蜜蜂液氮速冻，提取RNA，反转录cDNA，进行qPCR检测（95℃预变性30s;95℃变性5s,57℃退火40s,72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸5min）。所用引物列于表2。
表2qRT-PCR引物序列
1.2.3.2蛋白质印迹检测干扰效果
采用昆虫细胞蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，以每孔上样10μL进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，半干后转至NC膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1.5h。一抗AcerOr2(1∶1000)4℃过夜，二抗驴抗兔IgG室温温育2h,ECL显色，经显定影处理后，使用凝胶成像系统进行检测。
1.3数据处理
采用SPSS22.0软件对数据进行方差分析及差异显著性检验，统计方法采用Duncantest(P<0.05）进行。
2、结果与分析
2.1dsRNA模板合成检测
以中华蜜蜂气味受体AcerOr2(JN792581）和GFP(JQ064510.1）基因全长为模板，克隆得到含有T7启动子的AcerOr2和GFP基因片段后，测序验证，结果显示（图1、2），气味受体AcerOr2的3个大小不同片段的dsRNA合成模板和GFP的1个dsRNA合成模板均已加上T7启动子（绿色），该产物可以回收用于下一步dsRNA合成。
2.2体外合成的dsRNA检测
将合成的大小不同片段的dsRNA经浓度检测结果显示，其质量浓度均在8～10μg/μL。随后各取1μL10倍稀释后进行电泳检测，结果如图3所示，体外合成的中华蜜蜂AcerOr2(4～6）和GFP(7）的dsRNA片段大小与目标片段大小一致，可用于后续的基因沉默。
2.3最佳干扰片段筛选
用qPCR检测不同片段的干扰效果，结果如图4所示，饲喂3个片段大小不同的dsRNA(dsRNAAcerOr2-1(411bp）、dsRNAAcerOr2-2(205bp）、dsRNAAcerOr2-3(471bp））后对AcerOr2的表达量干扰效果不一样，且3个片段dsRNA分别以69.72%±0.49%、47.26%±0.25%、73.17%±0.97%的抑制率抑制AcerOr2的表达，其中，471bp的dsRNAAcerOr2-3抑制效率最佳。因此，选择其进行后续干扰试验。
用WesternBlot进一步检测不同片段干扰效果，结果如图5所示，与饲喂dsGFP对照组相比，饲喂dsRNAAcerOr2-1、dsRNAAcerOr2-1、dsRNAAcerOr2-3后目的蛋白的表达量均有不同程度降低，其中以dsRNAAcerOr2-3抑制率最佳。综合上述RNA检测结果，合成的dsRNA干扰片段在蛋白和RNA水平均能干扰AcerOr2的表达。
3、结论与讨论
RNA干扰是由小的非编码双链RNA诱发的真核细胞中基因沉默的现象，具有高效、快速、稳定、特异性强等特点，是昆虫嗅觉相关蛋白功能研究常用的方法[16]。能否顺利将外源dsRNA导入细胞是诱发RNAi效应成功与否的关键。
将外源dsRNA导入昆虫体内并诱发RNAi常用的方法主要有浸泡法、注射法、饲喂法[17,18]。其中，饲喂法是所有方法中操作最简便且是对昆虫造成机械损伤最小的方法，该方法最先是由FIRE发现，通过饲喂线虫CaenorhabditiselegansdsRNA可以诱发RNA干扰效应[19]。随后在蟋蟀[20]、白蚁[21]、意大利蜜蜂[22]等多种昆虫上都通过饲喂法成功干扰相关基因的表达。本研究采用饲喂法，并诱发中华蜜蜂体内气味受体RNA干扰效应，可为中华蜜蜂AcerOr2基因功能研究提供理论基础。
许多研究证明，长链dsRNA较短链dsRNA在昆虫中干扰效果更明显。例如在对果蝇（Drosophila）胚胎的RNA干扰中发现，长度为300～1000bp的dsRNA干扰活性最大，且RNAi效果随dsRNA链的增长而增强[23]。而对于同源性很高的基因，长链dsRNA则可能造成非靶标基因沉默的现象，这时短链dsRNA的干扰效果最好。本研究对中华蜜蜂气味受体AcerOr2设计并合成了3个不同大小的dsRNA片段进行RNAi，结果显示，411bp的短链dsRNA沉默效果最好，说明本试验所选的基因dsRNA片段大小对RNAi作用效果明显。
GFP是在水母中发现的一种蛋白质，中华蜜蜂体内没有该蛋白质，所以在昆虫RNAi中常被用作对照，以排除核酸本身对中华蜜蜂的影响；通过比较得出，目的基因表达量下降确实是由饲喂目的基因dsRNA所引起，而不是由饲喂外源基因dsRNA所引起。
与饲喂dsRNAGFP对照组相比，RNA干扰后中华蜜蜂体内AcerOr2蛋白相对表达量显著下降，而内参β-actin蛋白相对表达量没有发生变化，说明内源性目的基因AcerOr2被特异性抑制，并不是由于其他基因的沉默所导致。
本研究结果表明，通过饲喂中华蜜蜂dsRNA介导RNAi的方法对气味受体AcerOr2基因在其体内的干扰效果进行初步检测，结果显示，饲喂dsAcerOr2后能显著降低中华蜜蜂体内AcerOr2mRNA和蛋白表达水平，研究结果为后续进一步研究中华蜜蜂气味受体AcerOr2功能打下了基础。
参考文献：
[13]赵慧婷.中华蜜蜂气味受体基因Or1､Or2､Or3的鉴定､表达及定位分析[D].太谷:山西农业大学,2013.
[16]冯小艳,张树珍.RNAi作用机制及应用研究进展[J].生物技术通报,2017,33(5):1-8.
郭丽娜,赵慧婷,任有蛇,徐兵,姜玉锁.中华蜜蜂气味受体AcerOr2基因最佳干扰片段的筛选[J].山西农业科学,2020,48(06):860-864.
基金:优秀博士来晋奖励项目(K271899063);山西农业大学校青年科技创新项目(J141902180);山西省“1331”高校科技创新项目(J241942004).
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期刊名称：蜜蜂杂志
期刊人气：1957
主管单位：云南省农业科学院
主办单位：云南省农业科学院
出版地方：云南
专业分类：农业
国际刊号：1003-9139
国内刊号：53-1061/S
邮发代号：64-45
创刊时间：1981年
发行周期：月刊
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