摘要:盐酸多西环素主要通过抑制细菌蛋白质的合成而起到抗菌作用,在兽医临床上使用有许多的优点,且对于敏感菌所致的畜禽细菌性疾病的治疗,效果显著,因此在肉鸡和蛋鸡养殖中存在着一定的需求,本研究使用高效液相色谱-串联质谱法对多西环素在蛋鸡用药后的肌肉及鸡蛋中的残留情况进行了测定,结果表明,多西环素在蛋鸡体内肌肉中分布迅速,消除较快;在鸡蛋中含量高于肌肉中含量,消除需要一定时间。该测定方法可用于肉鸡或淘汰蛋鸡的肌肉和鸡蛋中的残留情况测定。
目前,动物性食品安全问题已成为畜牧业发展的一个主要矛盾,人们愈来愈关注动物体内的药物残留问题。盐酸多西环素主要药物成分是多西环素(Doxycycline,DOX)又名强力霉素或脱氧土霉素,系由土霉素6-位上脱氧而制成的半合成而成,主要通过抑制细菌蛋白质的合成而起到抗菌作用,对敏感菌,比如肺炎球菌、破伤风杆菌、棒状杆菌等革兰阳性菌,以及大肠杆菌、巴氏杆菌、布鲁杆菌,对立克次氏体、支原体、螺旋体等也有一定程度的抑制作用[1]。它作为半合成类抗菌药,其抗菌活性和组织穿透力都表现强,并具有体内分布广、临床上使用无明显肾毒性副作用、半衰期较长、较高的生物利用度等诸多优点,因此广泛应用于兽医临床[2]。随着研究的深入,不少学者也发现,多西环素不仅有抑菌作用,而且可能通过抑制炎症因子、信号通路以及基质金属蛋白酶等机制,在组织再生、修复,延缓组织退变等方面具有重要作用[3]。但多年来由于四环素类的广泛应用,临床常见病原菌对本品耐药现象严重,包括葡萄球菌等革兰阳性菌及多数革兰阴性杆菌均产生耐药性。多西环素与四环素类抗生素不同品种之间也存在着交叉耐药。动物试验表明多西环素有致畸性,体外试验表明在一定浓度时有致突变的可能。为此,国家各部门对抗生素的使用限制出台了各种规定[4]。多西环素在蛋鸡产蛋期和奶牛泌乳期禁用,家禽肌肉中残留限量为100µg/kg。多西环素在牛、猪、家禽的体内代谢方式基本相似,残留标志物为其原型本身。新修订的兽药药典中规定了多西环素在牛、羊、猪的休药期(WDT)暂定为28d[5]。总之,虽然多西环素残留对人体可能造成伤害,属于严控药物,但由于多西环素在临床上使用时有许多的优点,且对于敏感菌所致的畜禽细菌性疾病的治疗,效果显著[6],因此在肉鸡和蛋鸡养殖中存在着一定的需求,临床用药完后其残留情况的相关报道较少,对鸡蛋中的药物残留也很少报道,本文对多西环素在蛋鸡用药后的肉类残留及鸡蛋中的残留情况做了相关的试验。旨在研究多西环素残留在蛋鸡肌肉中以及鸡蛋中的残留状况。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1试验用蛋鸡
品种新杨黑,440日龄产蛋鸡48只,济南诺恩食品有限公司提供。
1.1.2仪器设备
高效液相色谱-串联质谱仪:配有荧光检测器、5.2pH计;电子天平:感量为0.0001g和0.01g;高速组织捣碎机;聚丙烯离心管;均质器:10000r/min;离心机:5000r/min;固相萃取柱:WatersOasisHLB小柱(6ml,200mg)或同类型小柱;固相萃取装置带负压抽滤器、旋转蒸发仪。
1.1.3试剂
试剂均为分析纯,试验用水符合GB/T6682中一级水标准。甲醇色谱纯、正己烷、柠檬酸、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、咪唑、醋酸镁、盐酸HCL、优级纯冰醋酸。标准品:多西环素,纯度>99%。
1.2方法
1.2.1给药方式和剂量
使用含量为5%的盐酸多西环素可溶性粉,2组分别加辅料1和辅料2按不同浓度使用3d,停药2d,即从第5天开始每天检测鸡肉以及鸡蛋中的盐酸多西环素残留含量,连续测6d。样品具体兑水量见表1:
表1给药方式和剂量
1.2.2检测样品的取得及制备
48只产蛋鸡分成2组,每组3只,从饮水机给药后第5天开始,每天随机抽取6只鸡蛋,鸡蛋经拍打器全部混匀后,取3份蛋液样品进行检测。每天屠宰3只鸡,取其胸脯肉作为样品,3只为3个样品。所有样品装入清洁容器细心管内,加封,-18℃以下冷冻保存。
1.2.3样品处理与检测
主要参考GB/T21317-2007[7]方法进行,将上述鸡肉样品、鸡蛋样品化开后分别称取一定的量进行前处理,并提取。提取后的上清液进行净化,净化所用固相萃取小柱预先依次用10ml甲醇、10ml蒸馏水、5ml柠檬酸缓冲液活化,取25ml提取液上样,控制速度在20滴/min,10ml蒸馏水洗涤,真空抽干,再用15ml甲醇洗脱,收集洗脱液于100ml的蒸发瓶中。40℃以下旋转蒸发至近干,用1ml磷酸二氢钾溶液溶解,经0.22µm微孔滤膜过滤,供测定。
1.2.4色谱条件和质谱条件
(1)色谱条件:色谱柱:BEHC18(50mm×21mm,1.7µm);柱温:40℃;进柱量:1µl;流速:0.3ml/min;流动相及梯度洗脱条件见表2。(2)质谱条件:电离模式:电喷雾正离子;毛细管电压:3.0kV;离子源温度:150℃;脱溶剂温度:350℃;脱溶剂氮气流速:800L/h;检测方式:多反应监测(MRM);定性:定量离子对见表3。
表2流动相及梯度洗脱条件
表3定性、定量离子对
2、结果与分析
2.1鸡蛋中多西环素残留检测结果
表4鸡蛋中多西环素残留量
从表4可以看出,鸡蛋中多西环素残留值因药物添加水平不一样,添加药物剂量大的一组第2组其残留含量一直稍大于第1组,从消除速度来看,蛋鸡对多西环素的降解速率还是很快的,第1组6d的消除速率为91.4%,第2组6d的消除速率为83.2%。
2.2鸡肉中多西环素残留检测结果
表5鸡肉中多西环素残留量
从表5可以看出,鸡肉中多西环素残留值因药物添加水平不一样,添加药物剂量大的一组第2组其残留含量一直稍大于第一组,但远小于相同组别鸡蛋中的残留值。从消除速度来看,蛋鸡在肌肉中的降解速率更快,第1组6d的消除速率达到100%,第2组6d的消除速率为98.4%。
2.3讨论
本试验设计为辅料不同的含量为50%的多西环素粉剂在蛋鸡体内的残留情况,辅料的不同可能会影响到蛋鸡吸收多西环素的水平,但无太多证据证明;但从本试验中可以看到,肌肉中的多西环素残留明显少于鸡蛋中,且在肌肉中的代谢速率很快,蛋鸡应用药物连续3d后,经过第4天的代谢,肌肉中的含量已经显示在国标允许的范围内,这与柳海[8]在多西环素药物残留在大黄鱼体内的消除规律一文中所述(多西环素在大黄鱼体内吸收、分布迅速,消除较快)相一致。而在鸡蛋中的代谢以及药物残留水平远高于肌肉,按照推算,在鸡蛋中的多西环素残留量仍将会持续数日才能满足标准的要求。这与王长青[9]用液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中多西环素的残留量结果相一致。
3、结论
本文通过对盐酸多西环素在蛋鸡中的残留状况初步研究,结果表明,多西环素在蛋鸡肌肉中分布迅速,消除较快;在鸡蛋中含量要远高于肌肉中含量,鸡蛋中的多西环素残留量的消除需要一定的时间。因此,在肉鸡或淘汰蛋鸡养殖过程中可以使用多西环素,注意用药时间即可。
参考文献:
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