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黄柏活性提取物对葡萄炭疽病的防效研究

2024-11-12 89 上传者：管理员

摘要：采用菌丝干质量法，研究黄柏不同提取方法获得的活性提取物对葡萄炭疽病病菌的室内抑制作用，筛选出抑菌活性较高的提取方法。以菌丝生长速率和孢子萌发率为指标，研究黄柏活性提取物对葡萄炭疽病病菌的室内抑制作用，并开展田间药效试验，评估黄柏活性提取物对葡萄炭疽病的田间防效。结果表明，4种提取方法获得的黄柏活性提取物对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制作用均有显著差异，随着提取物质量浓度的增加，抑制率提高。超声波辅助醇提取法获得的提取物表现较优，提取物质量浓度为3×104mg/L处理对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制作用最强，抑制率为87.01%，最低抑菌浓度（MIC）为1.04×104mg/L，对病菌孢子萌发的抑制率高达100.00%。田间药效试验结果表明，超声波辅助醇提取法获得的提取物浸膏400倍液对葡萄炭疽病的防效最高，为87.67%，明显优于该浸膏800、1 000倍液，也明显优于80%代森锰锌可湿性粉剂各稀释倍数处理。黄柏活性提取物对葡萄炭疽病具有较优的防效。

关键词：
抑菌作用
活性提取物
病菌
葡萄炭疽病
黄柏
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葡萄炭疽病主要由胶孢炭疽菌侵染引起，在葡萄栽培地区发生较多。该病原菌侵染近成熟期或成熟期葡萄果实，先在果粒表面形成红褐色针头大小的小斑点，之后病斑中心变黑并凹陷，逐步扩展到整个果面，果实变干皱缩。当环境湿度过大时，病变部位形成粉红色孢子团，再扩展至整株果穗，果实腐烂脱落，造成减产和较大的经济损失。南方高温湿热地区葡萄炭疽病较为常见，北方环渤海湾地区气候条件使酿酒葡萄产区葡萄炭疽病危害比较严重，西部干旱地区葡萄炭疽病比较少见[1]。目前栽培的葡萄品种多不抗葡萄炭疽病，且仍以化学防治为主。化学药剂的长期使用，使病原菌出现抗药性，增加防治难度。同时，大量使用化学药剂会造成生态环境恶化。因此，筛选出有效生物药剂，减少化学药剂使用量，对保障葡萄产业的绿色健康可持续发展意义重大。

我国幅员辽阔，拥有丰富的药用植物资源。许多植物含有杀菌的活性成分，已成为新型生物农药开发的重要资源。黄柏中起杀菌作用的活性成分主要是生物碱，其中小檗碱含量高达1.4%～5.8%，且黄柏碱、药根碱、掌叶防己碱、黄柏酮、黄柏内酯等活性成分含量也非常高，因而黄柏活性提取物具有较强的杀菌活性[2]。已有研究表明，黄柏提取物对番茄枯萎病菌有较强的抑制效果[3]。鲜见黄柏提取物在葡萄炭疽病防治上的应用。本文研究了基于不同提取工艺的黄柏活性提取物对葡萄炭疽病病菌的室内毒力，并选择抑菌活性较高的活性提取物开展田间药效试验，以验证黄柏活性提取物对葡萄炭疽病的田间防治效果，为葡萄炭疽病的生物防治药剂筛选提供参考。

1、材料与方法

1.1试验材料

供试黄柏产自辽宁本溪，购于大连中药市场，试验使用枝皮部位。

供试菌株收集自辽宁农业职业技术学院酿酒葡萄园采收的葡萄炭疽病典型病果，病果经马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养分离获得纯系菌株，保存于4℃冰箱备用。

供试药剂为西安近代科技实业有限公司生产的80%代森锰锌可湿性粉剂、无水乙醇（分析纯）和黄柏活性提取液（自制备）。

仪器设备为JA2004电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、S10200BDT奥特赛恩斯超声清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）、101型电热鼓风干燥箱（天津赛得利斯实验分析仪器制造厂）和RE-52A旋转蒸发仪（天津力辰科技有限公司）。

1.2室内试验

1.2.1黄柏提取液的制备

黄柏材料阴干，电热鼓风干燥箱中45℃恒温至干脆，粉碎机粉碎，过80目筛，筛下干粉储存备用。

1）水煮提取法。

称取50 g黄柏干粉，加入450 m L蒸馏水，浸泡30 min后加热煮沸，文火再加热30 min，减压抽滤，收集滤液，向残渣中再加入450 m L蒸馏水，同上处理，共提取3次，合并3次滤液。将滤液在40℃条件下减压浓缩至近干（呈浸膏状），用蒸馏水定容，使质量浓度为1×106mg/L，密封，标记后于4℃冰箱保存备用。

2）超声波辅助醇提取法。

称取50 g黄柏干粉，按液固比6∶1(m L/g），用70%乙醇浸泡，搅拌使黄柏干粉完全浸没在溶剂中，于避光处静置24 h。之后在45℃条件下，80 Hz超声辅助提取30 min，减压抽滤，收集滤液，残渣再次同上处理，共提取3次，合并3次滤液。滤液减压浓缩处理同水煮提取法。

3）超声波水提取法。

称取50 g黄柏干粉，加入100 m L蒸馏水搅拌浸泡，使黄柏干粉完全浸没在溶剂中，于避光处静置24 h，之后室温80 Hz超声辅助提取45 min，减压抽滤，收集滤液，残渣再次同上处理，共提取3次，合并3次滤液。滤液减压浓缩处理同水煮提取法。

4）醇回流提取法。

称取50 g黄柏干粉，用滤纸包实后置于250 m L索氏抽提器的提取罐中，加入95%乙醇100 m L，分别提取3 h、2 h和1 h，合并3次滤液。滤液减压浓缩处理同水煮提取法。

1.2.2室内毒力测定

采用菌丝干质量法，研究黄柏活性提取物对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制作用。使用100 m L PDA培养液将黄柏活性提取物分别稀释至3×104、2×104、1×104mg/L 3个质量浓度，在各浓度培养液中各加入直径为0.5 cm的葡萄炭疽病病菌菌饼3片，28℃振荡培养8 d。用已知质量的恒重滤纸过滤培养物，并将滤纸于80℃烘干至恒重。以无药剂的PDA培养液为空白对照，处理同上，每个处理设3次重复。分别称量4种提取方法获得的黄柏活性提取物各浓度菌丝干质量，计算抑菌率。计算方法：抑菌率（%）=（空白对照菌丝干质量-处理菌丝干质量）/空白对照菌丝干质量×100。

1.2.3最低抑菌浓度（MIC）的测定

基于室内毒力测定，筛选出最优提取方法，使用PDA培养液将获得的抑菌活性较高的黄柏提取液分别稀释成质量浓度为3×104、2×104、1×104、8×103、5×103、3×103、1×103mg/L的带药培养基，以不添加黄柏提取液的PDA培养基作为对照，每个处理3次重复。采用生长速率测定法测定抑菌活性。将直径为0.5 cm的葡萄炭疽病病原菌菌块接种到培养皿中心，28℃恒温培养，待对照处理菌落生长至平板的3/4时，采用十字交叉法测量各菌落直径，计算不同质量浓度黄柏活性提取物对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制率，并计算MIC[4]，即抑制率达到50%时黄柏活性提取物的质量浓度。计算方法：抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.2.4提取物对病菌孢子萌发的影响

基于室内毒力测定，筛选出最优提取方法，用PDA培养液将获得的抑菌活性较高的黄柏提取液分别稀释成质量浓度为3×104、2×104、1×104、8×103、5×103、3×103、1×103mg/L的带药固体培养基，采用平板计数法测定黄柏活性提取物对病菌孢子萌发的抑制作用[3]。将106CFU/m L葡萄炭疽病病菌孢子悬浮液稀释成浓度约100 CFU/m L，各吸取20μL菌悬液均匀涂布于含有不同质量浓度药物的培养基上，3次重复。28℃恒温培养4 d后，统计萌发率，以无药的PDA培养基作为对照进行菌落计数，计算抑制率。

1.3田间试验

1.3.1试验概况

试验于2023年7—9月在辽宁农业职业技术学院酿酒葡萄园进行。试验地块为沙壤土，肥水管理水平高。供试葡萄品种为赤霞珠，树龄为7年，行株距为1.0 m×0.8 m，篱架方式栽培。试验区域内树势一致，常年有葡萄炭疽病发生。

1.3.2试验设计

选取对炭疽病病菌抑制效果较好的黄柏活性提取物进行田间药效试验。试验共设7个处理，分别为黄柏活性提取物浸膏400、800、1 000倍液，80%代森锰锌可湿性粉剂400、800、1 000倍液，以喷洒等量清水为空白对照处理。随机区组设计，3次重复，小区面积10 m2(10.0 m×1.0 m）。

1.3.3试验方法

在葡萄炭疽病发生前进行试验，以GX35农用四冲程900背负式机动喷雾器喷雾药剂，使植株均匀着药。于8月5日首次喷药，喷药前先调查发病基数，每隔7 d喷药1次，连续喷药3次。末次喷药后12 d调查葡萄炭疽病发生情况。在每个试验小区随机取20个果穗，调查总果数及受害病果数，计算病果率及防效。计算方法：病果率（%）=病果数/总果数×100；防效（%）=（空白对照病果率-处理病果率）/空白对照病果率×100。

1.4数据处理

采用DPS 7.02数据处理系统进行Duncan′s新复极差多重比较。

2、结果与分析

2.1提取物对菌丝生长的抑制作用

由表1可知，4种提取方法获得的黄柏活性提取物对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制作用均有显著差异。除醇回流提取法外，黄柏活性提取物各质量浓度处理间也存在显著差异。其中，超声波辅助醇提取法提取物质量浓度为3×104mg/L处理对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制作用最强，抑制率高达87.01%，该方法提取物质量浓度为1×104mg/L处理对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制率为55.30%；其他3种提取方法提取物质量浓度为1×104mg/L时对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制率均不到40.00%。随着提取物质量浓度的提高，其对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制率增加。

表1 黄柏活性提取物对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制作用

2.2提取物对葡萄炭疽病菌的MIC

以超声波辅助醇提取法获得的黄柏活性提取物的质量浓度为横坐标，葡萄炭疽病菌菌丝生长的抑制率为纵坐标，获得抑制率的变化趋势，见图1。经对数拟合后，获得方程y=32.041ln x-246.25,R2=0.977 3。可以得出，黄柏活性提取物对葡萄炭疽病菌的MIC为1.04×104mg/L。

图1 黄柏活性提取物对葡萄炭疽病病菌的MIC

2.3提取物对病菌孢子萌发的影响

采用超声波辅助醇提取法获得的黄柏活性提取物对葡萄炭疽病病菌孢子萌发的抑制作用见表2。可以看出，黄柏活性提取物不同质量浓度对葡萄炭疽病病菌孢子的萌发均有显著抑制作用。当黄柏活性提取物质量浓度为3×104mg/L时，抑制率达100.00%；当黄柏活性提取物质量浓度为1×103mg/L时，抑制作用不明显，抑制率仅12.31%。随着质量浓度的降低，黄柏活性提取物的抑制作用减弱。

表2 黄柏活性提取物对葡萄炭疽病病菌孢子萌发的抑制作用

2.4防效

由表3可知，超声波辅助醇提取法获得的黄柏活性提取物浸膏400倍液对葡萄炭疽病的防效最高，为87.67%，显著优于其800、1 000倍液处理，也显著优于80%代森锰锌可湿性粉剂各稀释倍数处理。黄柏活性提取物浸膏800倍液对葡萄炭疽病的防效与80%代森锰锌400、800倍液差异不显著。80%代森锰锌可湿性粉剂1 000倍液对葡萄炭疽病的防效最低，仅为49.56%，而黄柏活性提取物浸膏1 000倍液对葡萄炭疽病的防效为60.52%。

表3 不同处理对葡萄炭疽病的防效

3、结论与讨论

我国药用植物资源丰富且种类繁多，可以为植物源农药开发提供丰富的资源。植物源农药是绿色农药，对提高农产品的品质和附加值意义重大。黄柏具有多种药理活性，已被广泛应用于医药领域，但仅有少量研究将黄柏提取物用于抑制植物病害病菌[5-6]，鲜见其抑制葡萄炭疽病病菌的研究。本研究结果表明，4种方法获得的黄柏活性提取物对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制作用均有显著差异，随着提取物质量浓度的增加，黄柏活性提取物对葡萄炭疽病病菌孢子萌发的抑制率提高。采用超声波辅助醇提取法获得的提取物，其质量浓度为3×104mg/L处理对葡萄炭疽病菌丝生长的抑制作用最强，抑制率高达87.01%,MIC为1.04×104mg/L，对病菌孢子萌发的抑制率高达100.00%。田间药效试验结果表明，超声波辅助醇提取法获得的黄柏活性提取物浸膏400倍液对葡萄炭疽病的防效最高，为87.67%，明显优于其浸膏800、1 000倍液，也明显优于80%代森锰锌可湿性粉剂各稀释倍数处理。黄柏活性提取物浸膏800倍液对葡萄炭疽病的防效为84.85%，与80%代森锰锌可湿性粉剂400、800倍液差异不显著。本试验仅研究黄柏活性提取物对葡萄炭疽病的防治效果，而黄柏活性提取物起抑菌作用的有效成分、作用机制、抑菌稳定性等相关内容有待进一步研究。

参考文献:

[1]刘梅,张玮,周莹,等.葡萄炭疽病研究进展[J].中国植保导刊,2014,34(1):29-33.

[2]陈阳峰,钟晓红.黄柏的药理作用及其活性成分提取[J].作物研究,2015,29(5):564-568.

[3]马欣,霍蓉,乔俊卿,等.黄柏提取物对番茄枯萎病的生物防治效果[J].江苏农业科学,2016,45(5):178-180.

[4]闫莉春,钱亚明,王西成,等.江苏省葡萄炭疽病菌群体对4种杀菌剂的敏感性[J].植物保护,2023,49(2):330-337.

[5]马欣,乔俊卿.中草药提取物对蔬菜土传病原真菌的抑制作用[J].安徽农业科学,2015,43(6):113-115.

[6]石洁,李宝燕,栾炳辉,等.5种生物药剂对葡萄炭疽病药效研究[J].中国果树,2021(1):74-76.

文章来源:关秀杰,郝宇,郝长红.黄柏活性提取物对葡萄炭疽病的防效研究[J].现代农业科技,2024,(21):60-63.