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河北省无创产前基因检测假阴性率评估与原因分析

2023-12-12 347 上传者：管理员

摘要：目的评估河北省无创产前基因检测(NIPT)假阴性率，并对假阴性的原因进行分析。方法基于河北省开展的NIPT民生项目，收集2019年7月—2022年6月项目实施期间发现的标准型21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征假阴性案例及其相关临床和实验室检测结果，进行NIPT假阴性率评估和假阴性原因分析，并对假阴性案例进行追踪随访，探讨进一步避免或减少假阴性出现的可能方案。结果在1 187 464例孕妇中共发现6例假阴性，其中4例为21-三体综合征，2例为18-三体综合征，总体假阴性率为0.51/10万，21-三体综合征为0.34/10万，18-三体综合征为0.17/10万。6例案例加测25M NIPT后结果依然为低风险。送检胎盘样本1例，存在低比例胎盘嵌合，嵌合比例平均为26%。初步明确了2例假阴性的可能原因，分别为双胎妊娠和胎盘嵌合。追踪随访结果显示6例案例中有4例发现超声异常。结论 NIPT对常见染色体非整倍体筛查的漏检率(假阴性率)极低，可以作为一线普筛技术推广应用。造成假阴性的主要原因可能是限制性胎盘嵌合。NIPT联合超声筛查可以进一步减少假阴性的出现。

关键词：
21-三体综合征
假阴性率
无创产前基因检测
胎盘嵌合
超声筛查
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无创产前基因检测(NIPT)是一种对孕妇外周血中游离DNA进行检测，结合生物信息学分析来判断胎儿是否患有染色体疾病的产前筛查技术，主要目标疾病为染色体非整倍性异常，包括21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征等，总体的灵敏度和特异度分别可达到99.43%和99.96%[1]。尽管NIPT的检测准确率较高，但仍存在少量假阴性(漏检)情况，可能导致孕妇外周血中异常胎儿游离DNA浓度降低的因素均可能导致假阴性的发生，如过度肥胖、双胎或多胎妊娠及胎盘嵌合等[2]。由于假阴性的出现率较低，以往的研究往往受限于样本数量较少和追踪随访不完善等因素而难以对NIPT假阴性率进行系统的评估。河北省于2019年7月开展NIPT民生项目，构建了政府主导、孕妇免费及全省覆盖的产前筛查模式，各项目定点机构按照筛查-诊断-干预-随访的统一流程和一体化服务模式执行[1],2019年7月—2022年6月项目实施期间共计成功筛查孕妇超118万例。本研究依托河北省NIPT民生项目数据，具备样本量大、随访工作系统完善的优势，对常见染色体非整倍体的假阴性率进行评估，并对发现的假阴性案例进行分析，探讨其发生的原因和避免措施。

1、资料与方法

1.1 资料来源

河北省自2019年7月起开展全省范围NIPT民生项目，辖区内建档立卡孕妇(含户籍人口和流动人口)在知情同意、自愿选择的前提下每孕期可免费接受一次NIPT筛查，高风险孕妇接受遗传咨询、产前诊断及干预指导，对所有接受NIPT的孕妇进行追踪随访。本研究收集2019年7月—2022年6月项目实施期间发现的标准型21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征假阴性案例，进行NIPT筛查常见染色体非整倍体假阴性率评估和原因分析，并对假阴性案例进行追踪随访，探讨进一步避免或减少假阴性出现的可能方案。本研究经河北省人民医院伦理委员会伦理审查并批准通过。

1.2 方法

1.2.1 NIPT假阴性案例的收集流程

NIPT筛查低风险(阴性)孕妇由项目定点筛查机构进行追踪随访，孕妇在常规孕期超声检查中发现异常并经产前诊断确诊为标准型21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征，或新生儿出生后因面容异常等原因进行核型检测确诊为标准型21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征则认定为假阴性案例。如发现假阴性案例会上报项目主管部门和技术专家组，并反馈项目定点检测实验室开展样本实验流程排查。此外，由于NIPT项目有标准型21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征假阴性案例的保险赔付，孕妇也可自行联系保险公司开启赔付流程，保险公司定期将案例情况反馈项目主管部门。汇总以上2种渠道得到NIPT假阴性案例信息。

1.2.2 筛查人群的基本特征统计和假阴性率评估

收集所有筛查孕妇的年龄、筛查孕周、是否双胎妊娠及是否体外受精(IVF)等基本信息，统计群体基本特征。分别计算NIPT筛查的总体假阴性率，21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征单独的假阴性率。

1.2.3 假阴性案例的基本信息收集和原因分析

收集假阴性案例的年龄、孕产次、胎数、身高、体质量及采样孕周等基本信息，计算每个案例的体质量指数(BMI)。检测实验室收到假阴性案例信息反馈后对样本的送检单、知情同意书、检测过程的原始记录及质控记录进行整体回顾；对该例样本初次NIPT检测剩余血样进行复测(含1次与初次NIPT检测一致的复测——6M DNA片段和1次加大数据量到25M DNA片段的复测),核查是否能检出高风险信号；对该例样本胎盘组织(如有送检)进行染色体微缺失/微重复检测。基于案例基本信息和实验室检测排查结果，从孕妇是否过度肥胖、胎儿DNA浓度是否达到NIPT检测阈值、是否双胎妊娠、是否胎盘嵌合及实验室检测流程是否存在异常等方面分析假阴性产生原因。

1.2.4 假阴性案例的追踪随访

本研究组对每例假阴性案例进行追踪随访，收集孕妇的孕期超声检查结果、产前诊断与核型检查结果、妊娠结局及新生儿健康状况等信息，分析假阴性案例的其他检出手段，探讨进一步避免或减少假阴性出现的可能方案。

1.3 统计学分析

采用Microsoft Excel软件进行统计学分析。连续型变量采用均值±标准差(表示，分类变量采用频数(%)表示。统计计算假阴性率(假阴性数/筛查孕妇总数)、孕妇BMI、NIPT检测平均Z值及平均胎儿DNA浓度等，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 NIPT筛查人群特征和常见染色体非整倍体假阴性率评估

河北省NIPT民生项目2019年7月—2022年6月共成功筛查孕妇1 187 464例，孕妇平均年龄为(28.9±4.6)岁，高龄孕妇(35岁以上)占10.9%(129 760/1 187 464),平均筛查孕周为(16.8±2.3)周，双胎孕妇占1.4%(17 007/1 187 464),IVF 孕妇占1.8%(21 193/1 187 464)。NIPT筛查共发现常见染色体非整倍体(标准型)假阴性6例，其中21-三体综合征4例，18-三体综合征2例；总体假阴性率为0.51/10万，其中21-三体综合征假阴性率为0.34/10万，18-三体综合征假阴性率为0.17/10万。

2.2 假阴性原因分析

对可能造成假阴性的原因(主要包括孕妇是否存在过度肥胖、双胎妊娠及胎盘嵌合等)进行分析，并对实验室检测流程进行复核排查。假阴性孕妇中，除了1例孕妇(NO.5)未登记身高、体质量无法计算BMI外，其余孕妇的BMI分别为21.1 kg/m2、21.9 kg/m2、23.3 kg/m2、25.5 kg/m2及25.7 kg/m2,不存在过度肥胖的案例。有1例孕妇(NO.4)为双胎妊娠，其余孕妇均为单胎妊娠。有1例孕妇(NO.2)自愿参与研究送检胎盘样本，实验室检测结果显示6块组织分别存在19%、20%、23%、28%、33%及35%比例的21-三体综合征嵌合，平均嵌合比例为26%。其余孕妇未送检胎盘组织用于验证。

对假阴性案例的实验室检测流程进行了排查，检测过程的原始记录和质控记录未见异常，剩余血样复测和加大数据量加测结果如下。假阴性案例初次NIPT检测的平均Z值为1.11(-0.24～1.73),平均胎儿DNA浓度为16.41%(7.26%～22.24%);第2次复测的平均Z值为1.01(-1.06～2.29),平均胎儿DNA浓度为17.55%(8.51%～22.85%);第三次复测(加大数据量到25M DNA片段的检测)的平均Z值为1.07(-1.22～2.70),平均胎儿DNA浓度为17.38%(7.43%～23.16%)。尽管后2次检测的Z值与初次NIPT检测相比有一些变化，但均在低风险阈值范围内(Z值<3为低风险),且3次检测的Z值平均值接近，说明总体的重复检测效果稳定。此外胎儿DNA浓度也均超过了NIPT最低检测阈值(≥4%)。见表1。

对假阴性的原因进行了分析，排除了孕妇过度肥胖、胎儿DNA浓度未达到NIPT检测阈值及实验室检测流程异常等情况，6例假阴性案例中1例的可能原因为双胎妊娠，1例的可能原因为胎盘嵌合，其余4例未明确原因，怀疑可能为胎盘嵌合。

2.3 假阴性案例追踪随访结果

回顾了6例假阴性案例的孕期超声检查结果，其中4例单胎妊娠孕妇均检出多项超声软指标异常，包括胎儿头围和股骨小于实际孕周(NO.2和NO.6)、鼻骨缺失(NO.1和NO.2)、NT增厚(NO.1)、右心室强光斑(NO.1)、心包积液(NO.2)、宫内发育迟缓(NO.5)、室间隔缺损(NO.5)、脐带囊肿(NO.5)及双侧脉络丛囊肿(NO.6)等。见图1。发现超声异常后孕妇均接受产前诊断(羊水穿刺或脐血穿刺),经染色体核型分析确诊为染色体非整倍体，4例孕妇和家属经充分告知遗传风险后均选择终止妊娠。

另有1例单胎妊娠孕妇(NO.3)在孕期超声检查中未发现异常，分娩新生儿后查体发现面容异常，经染色体核型检测确诊为21-三体综合征。剩余1例双胎妊娠孕妇(NO.4)在知晓高龄和双胎双重风险因素情况下签署知情同意书要求做NIPT(结果提示低风险),后续未进行规范的超声检查，分娩双胎新生儿后查体发现其中1例眼裂小、双手通贯掌，心脏彩超检查提示动脉导管未闭、卵圆孔未闭，经染色体核型检测确诊为21-三体综合征。案例的基本信息和临床表征见表2。

表1 6例NIPT假阴性案例的BMI和实验室检测结果

图1 假阴性案例超声结果

表2 6例NIPT假阴性案例的基本信息和临床表征

3、讨论

自2010年起，NIPT开始应用于临床，因其具有灵敏度高、特异度好、阳性预测值高及安全无创等优点，目前在产前筛查中得到广泛应用[3,4,5]。孕妇血浆中的游离DNA大部分来自母体自身细胞降解所释放的游离DNA,少部分来源于胎盘滋养层细胞释放的游离胎儿DNA,通常认为游离胎儿DNA可以准确反映胎儿的遗传信息[6,7,8],但在临床实践过程中，时常发现NIPT的假阴性案例。相关文献[9,10,11,12]报道显示，21-三体综合征的假阴性率为(3.37～6.99)/10万，18-三体综合征的假阴性率为(0.67～4.90)/10万，本研究数据显示21-三体综合征和18-三体综合征的假阴性率分别为0.34/10万和0.17/10万，远低于文献报道数据。河北省NIPT项目是一项民生工程，各项目定点机构按照筛查-诊断-干预-随访的统一流程和一体化服务模式执行，有专人对所有受检孕妇进行随访，同时保险理赔数据还可以对假阴性案例起到印证补充作用，因此实际存在假阴性而未能发现的可能性较低；此外本研究统计的是标准型常见染色体三体综合征，不包含异位型和嵌合型，这可能是与文献报道存在差异的一个原因；最后由于存在一些自然流产或直接引产的案例，这些案例无法确定是否存在染色体非整倍体，从而可能会“遗漏”一些假阴性案例。本研究数据表明河北省NIPT民生项目实践对于标准型常见染色体三体综合征漏检率(假阴性率)极低。

本研究对发现的6例假阴性案例进行了分析，孕妇的BMI在21.1～25.7 kg/m2之间，不存在过度肥胖的情况；胎儿的DNA浓度在7.26%～23.16%之间，高于NIPT最低检出阈值(4%),这基本上排除了因为过度肥胖或胎儿DNA浓度低造成假阴性的情况。其中1例孕妇为双胎妊娠，分娩后1例新生儿正常，另1例为21-三体综合征，这个案例可能是因双胎造成了异常胎儿DNA被“稀释”而未能检出。另有1例孕妇送检了胎盘，检测结果显示存在低比例胎盘嵌合，嵌合比例平均为26%,这可能是造成假阴性的主要原因。其余4例孕妇未能明确假阴性原因，考虑到这几例孕妇均为单胎妊娠，推测因胎盘嵌合造成假阴性的可能性最大，但是孕妇未送检胎盘无法验证。每个假阴性案例均进行了3次NIPT检测，其中1次还将数据量加大到25M,虽然每次检测得到的染色体非整倍体Z值不尽相同，但是均未达到高风险阈值(Z≥3判定为高风险),这表明加大检测数据量到25M可能对假阴性案例的检出没有帮助，进一步增加检测数据量是否能改变这一情况还需要后续研究验证。有研究[10]表明，通过富集短片段游离DNA,提升胎儿游离DNA的相对浓度，可以将部分初次检测阴性的案例检出，这可能是进一步降低假阴性率的一个研究方向。

超声检查是产前检查的重要手段，其检出的胎儿颈项透明带/颈部皮肤皱褶增厚、脉络丛囊肿、侧脑室扩张、肾盂增宽、心室内强回声光斑、股骨短小、鼻骨短小或缺失及小颌畸形等[13,14]常见超声软指标异常往往提示胎儿染色体异常风险增高[15,16]。不同超声软指标的预测价值不同，孕中期胎儿颈部软组织增厚与染色体异常关系最为密切，其次为鼻骨缺失，侧脑室轻度扩张，心室内强回声光斑也轻度增加染色体异常风险[17]。本研究中6例假阴性案例中的4例(66.67%)是因孕期超声检查发现了包括胎儿鼻骨缺失和心室内强回声光斑等染色体异常高风险指标的异常结果，继而行产前诊断确诊的，这体现了超声检查与NIPT的互补作用。这些假阴性案例均发现2项及以上超声软指标异常，这提示发现多项超声软指标异常的情况下胎儿存在染色体异常的风险可能更高。NIPT结合超声检查可进一步减少假阴性的出现。

河北省是全国第一个在全省范围开展NIPT项目的省份，构建了政府主导、孕妇免费及全省覆盖的产前筛查模式，超过118万例孕妇筛查数据表明在当前技术条件下，NIPT对常见染色体非整倍体筛查的漏检率(假阴性率)极低，可以作为一线普筛技术推广应用。同时超声筛查可以进一步减少假阴性的出现，孕妇在检出关键超声软指标异常时建议进行产前诊断，从而最大程度避免出生缺陷患儿的出生。

参考文献:

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基金资助:河北省政府资助专科带头人培养项目(2018674);河北省重点研发计划项目(21377720D);

文章来源:刘静,苏茜,梅冰等.河北省无创产前基因检测假阴性率评估与原因分析[J].中国妇幼保健,2023,38(24):4921-4925.