食源性疾病是指通过摄入食物而使病原体进入人体导致人体发生感染性或中毒性疾病，是全球最广泛、最常见的公共卫生问题之一。据2023年世界卫生组织报道，平均每天有160万人因不安全的食品而患病，全世界每年有1/10的人口受到食源性疾病的影响，平均每天有340名5岁以下儿童死于可预防的食源性疾病[1,2]。食源性疾病的主要诱因之一是食源性致病菌，这些致病菌包括沙门菌、大肠埃希菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肉毒杆菌、志贺菌、弯曲杆菌和单核细胞增生李斯特菌等，它们广泛存在于农产品、乳制品、动物源性食品和生活环境中，容易引起食源性疾病的暴发。近年国内外有多起食源性致病菌感染案例，多由沙门菌[3,4]、大肠埃希菌[5]、金黄色葡萄球菌[6]引发食物中毒事件，也有感染李斯特菌而导致死亡的案例。

食源性致病菌造成的危害越来越严重，因此需要有效的方法进行早期监测实现防控。致病菌的传统检测方法包括微生物培养、实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，但这些方法费时、费力且成本高，无法满足食品快速检测的需求[7]。因此，迫切需要高灵敏快速的新型检测方法。

规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及相关蛋白（CRISPR⁃associated protein,Cas）构成的CRISPR⁃Cas系统是一种强大的基因编辑工具，基于其对靶标核酸的特异性识别及切割活性，目前已广泛用于核酸检测领域。基于CRISPR的核酸检测技术具有高特异性、高灵敏性的特点，为病原体识别和检测提供强大助力。其中CRISPR⁃Cas12a系统具有精确的核酸靶向和切割功能，通常与各种基于核酸扩增的信号放大技术结合[8]从而进一步提高该系统的检测灵敏度和特异性，在食源性致病菌的检测中有着广阔的应用前景。本文主要介绍CRISPR⁃Cas12a系统的原理和机制以及常用的信号读出技术，分析CRISPR⁃Cas12a系统在快速检测中的研究进展、当前面临挑战和未来应用前景。

1、 CRISPR-Cas12a的检测原理

CRISPR⁃Cas系统是一种广泛存在于多数细菌和古细菌中的适应性免疫系统[9]，其作用是阻止噬菌体等外来核酸的入侵。CRISPR⁃Cas系统根据不同的Cas蛋白可分为两类，即CRISPR⁃Cas 1类和2类[10]，每一类由若干亚型组成。CRISPR⁃Cas 1类系统包括多种效应蛋白的复合物，其中每种蛋白在CRISPR过程中执行单一功能，多种蛋白一起协同作用才能激活性。CRISPR⁃Cas 2类系统的特点是Cas蛋白为具有多种功能的单一效应蛋白。另外，根据Cas蛋白的基因结构和重复间隔序列结构不同可分为6型：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型属于第1类系统，Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型属于第2类系统。第2类系统由于其简单和高效的结构，在生物工程和基于CRISPR的诊断中使用最多[11]。

Cas12a是Ⅴ型CRISPR⁃Cas系统的核酸内切酶[12]，其在crRNA的引导下利用单一的RuvC催化域进行单链DNA的无差别切割。crRNA是一段含有保守重复序列和间隔区的RNA序列，其中重复序列含有回文序列，可形成发卡结构，而间隔区则与目标片段PAM位点之后的序列碱基互补配对，长度为20～23 bp。Cas12a蛋白介导的CRISPR系统具有如下特点：（1)CRISPR⁃Cas12a系统直接被成熟的crRNA激活，不需要tracrRNA（反式作用CRISPR RNA）参与向导RNA的合成；（2）含有RuvC核酸酶结构域的CRISPR⁃Cas12a二元复合体通过识别富含T的短序列PAM(5′⁃TTTN⁃3′）来激活酶活性；（3)CRISPR⁃Cas12a酶切系统在dsDNA切割后引入4或5个核苷酸黏端。黏端增加了同源重组修复的可能性，有利于外源基因的引入。

经典的CRISPR⁃Cas9系统需要Cas9蛋白（Ⅱ型效应蛋白）、crRNA和tracrRNA协同发挥作用，其中crRNA与tracrRNA合并设计形成一条单链向导RNA(single⁃guide RNA,sgRNA），当Cas9与crRNA部分结合后，能够识别含有靶点相邻基序（protospacer adjacent motif,PAM）位点（5′⁃NGG）的靶标dsDNA,crRNA与靶标dsDNA中的互补链形成RNA⁃DNA异源双链结构，随后Cas9的2个核酸酶结构域活性被激活，进而切断靶标dsDNA。而Cas12a系统不需要tracrRNA，只需与crRNA结合形成复合物就能识别PAM序列，并且Cas12a蛋白具有特异切割靶标单链DNA(ssDNA）的反式切割活性，具有信号放大作用从而提高灵敏性。与Ⅱ型和Ⅴ型效应蛋白靶向ssDNA或dsDNA不同，Ⅵ型效应蛋白特异性靶向RNA序列。Cas13蛋白将ssRNA作为报告分子发挥反式切割活性，但ssRNA极易被环境中的RNA酶降解，不及DNA稳定。与Cas9系统相似，CRISPR⁃Cas14系统也需要Cas蛋白、crRNA和tracrRNA协同发挥作用。Cas14蛋白在功能上虽与Cas12蛋白相似，但需额外的T7核酸酶外切酶步骤。因此，相比Cas9、Cas13、Cas14系统，Cas12a系统具有以下特点：不需要tracrRNA参与、识别富含T的短序列PAM(5′⁃TTTN⁃3′），具有特异反式切割活性，识别靶标为DNA，从而具有更广泛的应用价值。

2、基于CRISPR-Cas12a的检测技术

CRISPR⁃Cas12a系统在crRNA的引导下特异性识别含有PAM位点的靶标DNA，激活Cas12a蛋白的反式切割活性，对ssDNA进行无差别切割从而发挥信号放大的作用。在食源性微生物的检测中，由于食品样品的基质复杂、干扰物多以及存在靶标物痕量的问题，所以在CRISPR检测前通常需要核酸扩增技术来提高靶标浓度，如PCR、重组酶聚合酶等温扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）、环介导等温扩增（loop⁃mediated isothermal amplification,LAMP）。除进行前置的核酸扩增步骤外，还需要灵敏快速的信号读出技术来检测结果。CRISPR⁃Cas12a检测技术中最经典的信号读出是利用猝灭⁃荧光团修饰的ssDNA探针来产生荧光信号，基于该信号构建了一系列检测平台。但由于依赖实验室设备、操作繁琐、容易造成污染等问题，在信号读出方面开发了许多新的技术和设备，在此详述荧光信号、比色法、电化学信号检测等方面进展（图1）。

图1 3种基于CRISPR-Cas12a的信号读出方法

2.1荧光信号检测

荧光是基于CRISPR⁃Cas12的检测中被广泛使用的读出信号，适用于快速检测、定量检测。ssDNA可以连接特殊的标记，从而生成可以观察或检测到的信号。最常用的标记方法即两端修饰荧光⁃猝灭基团，通过荧光检测设备观察信号，根据信号有无判断靶标是否存在以及根据实时荧光强度进行定量。Li等[13]提出了一种基于CRISPR⁃Cas12a的荧光检测平台，名为“Cas12aFDet”，用于快速核酸检测。通过在封闭管中将PCR或重组酶辅助扩增（recom⁃binase⁃aided amplification,RAA）与CRISPR⁃Cas12a相结合，可以在15 min内完成扩增产物的检测，同时避免扩增子污染。基于PCR的Cas12aFDet和基于RAA的Cas12aFDet对单核细胞增生李斯特菌血清型4c纯培养物的检出限为3.37×101和1.35×102cfu/mL，基于RAA的Cas12aFDet对DNA检测的灵敏度为0.64 amol/L，对检测其他血清型的李斯特菌和非李斯特菌菌株表现出高特异性。此外，基于RAA的Cas12aFDet方法可以定量检测1.35×108～1.35×103cfu/g的单核细胞增生李斯特菌血清型4c。

同时荧光信号在特定波长光照下可以被肉眼观察，因此也适用于现场检测。Shi等[14]开发了一种单管CRISPR⁃Cas12a增强环介导等温扩增LAMP(CRISPR⁃Cas12a⁃E⁃LAMP）方法，用于肉眼检测福氏链球菌。整个检测可以在40 min内完成，通过在LED蓝光下是否产生荧光信号判断检测结果，反应灵敏性达到4拷贝/μL，成为现场、临床和资源有限环境下快速检测福氏链球菌的有效方法。

Zhang等[15]选择副溶血性弧菌特殊热不稳定溶血素基因的一段序列作为靶序列，设计相应的crRNA，将CRISPR⁃Cas12a反应液预先安装在试管盖上，再安装在开盖的微型热循环器上，然后对从虾中提取的样品进行PCR扩增。将混合试剂离心，37℃孵育5～10 min，紫外灯下肉眼读取，检出限为1.02×102拷贝/μL。

2.2比色法检测

显色反应是一种灵敏的变色反应，被广泛应用于各种分子的比色检测，其操作简单，不需要复杂的仪器，适用于快速检测。在基于CRISPR⁃Cas12a的检测中，主要有2种生成比色信号的方式：一种是将各种显色反应与Cas12a相结合，如TMB⁃H2O2反应[16]、各种酶促反应等[17,18]；另一种是使用可以自身显色的报告子，如纳米金探针[19]和不同的G⁃四链体（G⁃quadruplex,G4）报告子[20,21]。

Chen等[20]针对副溶血性弧菌的可视化检测提出了一种通过与比色法结合的具有特异性、无需标记的新检测方法。该方法利用CRISPR⁃Cas12a系统特异性识别LAMP扩增产物，对G4 DNA酶进行反式切割并阻断其类似过氧化物酶活性。G4是通过在富含G的序列中堆叠Hoogsteen碱基配对的G⁃四联体而形成的四链核酸结构，它们在结合血红素后具有类似过氧化物酶的活性，利用G4 DNA酶可以很容易地将DNA序列信号转换为比色读数。通过这种方式，可以根据2,2′⁃叠氮基二⁃（3⁃乙基苯并噻唑啉⁃6⁃磺酸）（ABTS2-）的显色用肉眼直接观察结果，其对于阳性样品显示无色，对阴性样品显示绿色。

Jiang等[22]开发了一种由CRISPR⁃Cas12a介导的链置换/杂交链式反应（CRISPR⁃Cas12a mediated strand displacement/hybridization chain reaction,CSDHCR）核酸检测方法，用于食源性致病菌的比色检测。生物素修饰的ssDNA连接在抗生物素磁珠上，并作为引发链触发SDHCR。SDHCR扩增允许基于G⁃四链体的DNAzyme产物催化TMB⁃H2O2反应。当存在DNA靶标时，CRISPR⁃Cas12a的反式切割活性被激活以切割ssDNA，导致SDHCR失败且无颜色变化。该方法具有高特异性和灵敏性，与重组酶聚合酶扩增结合检测创伤弧菌检出限为1.0 cfu/mL。

2.3电化学信号检测

与荧光检测相比，电化学信号检测具有相对优势的成本效益和便携性。一个非特异性的ssDNA报告因子3′端修饰一个亚甲基蓝（MB),MB作为氧化还原指示剂，产生电流信号用于信号转导[23],5′端修饰一个巯基片段，通过Au⁃S键固定在金纳米修饰的电极上。因此，在金电极和ssDNA上的氧化还原活性物质之间的电子转移过程可以由电化学引发和转导。当靶标存在时，Cas12a反式切割活性被激活，将MB⁃ssDNA报告基因从电极表面切割掉，从而减少了MB信号转导[24]。当靶标不存在时，Cas12a反式切割活性不被激活，MB⁃ssDNA报告基因保留在表面。Zheng等[25]首次报道了一种基于跨越式滚环等温扩增（saltatoryrollingcircleamplification,SRCA）与CRISPR⁃Cas12a系统结合的电化学生物传感器用于检测沙门菌。该方法的检测范围为5.8 fg/μL～5.8 ng/μL,LOD为2.08 fg/μL。对于实际样品的检测，该生物传感器表现出良好的灵敏度、准确度和特异性，与实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR）一致。该生物传感器为检测食品中的沙门菌提供了一个有效平台，并为其他食源性致病菌的检测提供技术支持,有可能用于检测其他食源性致病菌。Huang等[26]同样基于SRCA和CRISPR⁃Cas12a系统建立了用于检测金黄色葡萄球菌的电化学生物传感器实现准确检测。在最佳条件下，纯培养基中基因组DNA的检测限分别为2.51 fg/μL和3 cfu/mL。

电化学核酸传感器具有结构简单、易于小型化、成本低、响应快、灵敏度高等优点，可将生化信号转换为电信号，易于与电子仪器集成组装，方便携带。Bu等[27]基于CRISPR⁃Cas12a系统实现了对大肠埃希菌O157∶H7的超灵敏检测。该方法首先设计一个由适配体锁定的db⁃ap⁃hp PER结构，在目标细菌存在时，适配体可以特异性结合从而暴露Hp链。经过引物⁃链结合、链替换延伸、分支迁移和转录分离，进入下一个循环。分离产生的新链用于激活Cas12a蛋白并切割MB⁃ssDNA电化学信号探针。该方法的检出限为19 cfu/mL，线性范围为101～106cfu/mL，与Chen等[28]基于CRISPR⁃Cas12a和RCA扩增联合检测大肠埃希菌O157∶H7的结果基本一致。

Bonini等[29]建立了基于CRISPR⁃Cas12a的无标记阻抗生物传感检测大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的方法。电化学阻抗谱可以灵敏快速地检测电极表面微小的物理和化学信号变化。电极上修饰的ssDNA可以阻碍电极与溶液之间的电子交换。当CRISPR⁃Cas12a识别目标细菌的特定序列时，激活对ssDNA切割活性，导致电荷转移阻力降低。

3、基于CRISPR-Cas多重检测技术的研究

多重核酸检测具有诊断能力强、节省时间、信息量大的优势，而且病原体的快速、低成本和多重检测对人类健康和全球安全具有重要价值，一些临床诊断也需要快速检测不同的核酸。多重核酸检测常规的使用方法，如RT⁃qPCR、微阵列和下一代测序，它们虽然可以进行广泛、准确的病原体识别，但需要繁琐且昂贵的仪器设备，在资源有限的实验室或地区不能广泛使用。因此结合CRISPR⁃Cas系统能解决成本和时间问题，并且具备高特异性和灵敏性的特点。

Fu等[30]通过将RPA与CRISPR⁃Cas12a结合，开发了一种超灵敏的双检测平台，可同时检测沙门菌的毒力基因和耐药基因。利用圆盖相对平盖能储存更多检测溶液的优点，实现一体化检测从而减少气溶胶污染，使用微孔板读数器和紫外可视化检测实现双模式读取结果，并且具有现场检测的可能。该平台在40 min内没有任何交叉反应，检测限可达到1 cfu/mL，比现有方法提高了1～2个数量级，而且避免了液体基质食品中蛋白质和脂肪的影响，主要用于检测牛奶和脱脂奶粉中的耐药沙门菌，双检测限为1 cfu/mL，加标回收率为68.58%～158.49%，同时用于沙门菌耐药性分析。

Hu等[31]报道了一种低成本的多重靶标检测方法，即基于CRISPR的反向斑点杂交（CRISPR⁃RDB），使用一种微型和便宜的尼龙膜进行信号读出，可同时检测4个核酸靶点，具有高灵敏度和特异性、成本低、无需依赖仪器、易于携带和可视化等优点。CRISPR⁃RDB将CRISPR⁃Cas12a的反式切割活性与RDB技术相结合，利用不同的Cas12a⁃crRNA复合物分别识别一个样本中的多个靶标，并在一块微小尼龙膜上将靶标信息转换为比色信号，该尼龙膜连接相应的特异性寡核苷酸探针。通过构建四通道系统来同时检测甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型，crRNA识别相应的靶标，微流体芯片系统将4个样本划分到一个单独的微流体室中，每个区域通过来自同一样本设计的Cas12a⁃crRNA识别其目标，与金标准qPCR比较，CRISPR⁃RDB分析结果显示出与临床样本一致的结果。另外，通过对crRNA的简单修饰，CRISPR⁃RDB可以检测人乳头瘤病毒，与商业PCR⁃RDB试剂盒相比，节省了大量时间。

Xu等[32]通过CRISPR⁃Cas12a与多重重组酶聚合酶扩增相结合，建立了一个名为MiCaR的核酸检测平台。MiCaR只需一个荧光探针，就可以通过微流体空间编码同时检测多达30个核酸靶点，检测限达到0.26 amol，检测过程仅需40 min。通过有效检测9价HPV疫苗靶向的9种HPV亚型证明了MiCaR的准确性和可行性，在检测100份有HPV感染风险的患者样本时灵敏度为97.8%、特异度为98.1%。随后将MiCaR成功应用于8种临床上最相关的呼吸道病毒检测，展示了MiCaR的可推广性。

4、无扩增CRISPR-Cas检测技术的发展

基于CRISPR⁃Cas的检测方法通常需要预扩增步骤来提高分析物的数量和浓度，但预扩增不仅延长了检测时间，而且对后续检测造成了影响，如非特异性扩增的存在和引物之间的干扰。另外，先预扩增后检测的两步反应体系，增加了气溶胶污染的风险。有研究提出了单管反应解决方案，但在一定程度上牺牲了2个反应各自的最佳性能。因此，建立基于CRISPR⁃Cas系统但无需靶标扩增的检测方法成为研究趋势，同时要求能最大限度地减少由于缺乏预扩增而造成的灵敏度损失，还可实现对非核酸靶标的检测，并促进在便携式设备中的使用[33]。

目前已有的多种基于CRISPR⁃Cas的无扩增检测方案的研究，虽省略了用于提高靶浓度的预扩增步骤，但同样表现出高特异性、灵敏性和耗时短的优点。Choi等[34]首次开发了基于CRISPR⁃Cas12a的无核酸扩增荧光生物传感器，使用DNA功能化的Au纳米粒子（AuNP）通过金属增强荧光（metal⁃enhancedfluorescence,MEF）检测cfDNA。当靶cfDNA激活CRISPR⁃Cas12a复合物并随后在AuNP和荧光基团之间降解ssDNA时，MEF发生颜色从紫色到红紫色的变化。使用该系统可以在30 min内以非常高的灵敏度检测到乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1）。这种快速、高特异性的传感器可推广用于检测其他核酸。同时，无扩增CRISPR⁃Cas检测技术的检测目标也已从核酸扩展到其他分析物，如活细菌细胞、蛋白质和金属离子。

由于Cas核酸酶反应条件温和、检测时间短，而且无扩增的CRISPR⁃Cas检测技术消除了复杂的目标扩增过程，显示出与便携式设备的良好兼容性，在现场检测和家庭诊断中显示出应用前景。与微流控芯片反应器和便携式信号收集器（如智能手机作为信号分析仪）或比色侧流分析技术相结合，基于无扩增CRISPR⁃Cas的检测方法可较易用于开发通用即时检测平台。基于CRISPR⁃Cas的检测方法在无前置信号放大步骤的条件下，可在5 min内的对样本进行反应应答[35]，比金标准（通常为4～6 h）短得多。在新冠肺炎全球大流行期间，基于无扩增CRISPR⁃Cas的检测技术能够应对疫情的快速扩大，并有助于控制大流行[36]。然而，与最先进的技术特异性高灵敏度酶解反应器（specific high sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing,SHERLOCK）、DNA内切酶靶向CRISPR反式报告系统（DNAendonuclease⁃targeted CRISPR transreporter,DETECTR）或其他金标准方法相比，仍有必要进一步提高无靶扩增CRISPR⁃Cas检测系统在amol/L甚至单分子水平的灵敏度。

5、总结与展望

CRISPR⁃Cas12a作为新型基因编辑技术，结合各种核酸扩增技术不仅提高了检测方法的灵敏度、特异性，而且扩展了其应用范围，使其从实验室到现场应用成为了可能。目前已建立的基于CRISPR⁃Cas技术的核酸检测方法，大多都具有以下优点：操作简便易于开发，对单碱基突变有很高的分辨率，能达到amol/L级检测限，不需要专业仪器，可通过可视化进行信号读取，能够实现现场检测及多重检测等。但基于CRISPR⁃Cas12a系统的检测方法仍面临着挑战：（1）基于CRISPR的检测技术通常依赖于比色、荧光或电化学信号这3种信号读出技术，涉及昂贵或者复杂设备。比色法相对简单，但其灵敏性低于荧光和电化学信号，灵敏度较低的肉眼信号读数适用于现场的初步筛查，所以需要结合更灵敏、便携的信号读出技术，如个人血糖仪（personal glucose meter,PGM)[37]是一种经典的即时检测设备，在信号转导方面具有独特的应用优势。目前，许多研究[38,39,40,41]已经使用基于PGM的生物传感器和信号放大技术来实现对食品危害的灵敏和特异性检测。另外，有研究通过将双链λDNA的大小调整为新型报告分子来检测ssDNA靶标，建立了一种简单、廉价、非光学且灵敏的基于CRISPR⁃Cas12a的传感平台[42]。（2）基于CRISPR的检测技术目前多数依赖于前置信号放大，如PCR、RPA和LAMP。但前置的预扩增步骤容易引入非特异性扩增子和引物造成污染，而且延长了检测时间，因此如何实现无扩增的CRISPR检测是当前面临的主要挑战。（3）由于Cas9和Cas12蛋白在识别并结合靶序列时，均具有PAM序列依赖性。而Cas14不需依赖PAM,Cas13效应蛋白虽不需要PAM序列，但具有原间隔器侧翼位点（protospacer flanking site,PFS）。所以开发更多无需依赖PAM位点或通过次优PAM序列（如VTTV,TTVV等）取代典型PAM序列（TTTV）的Cas检测系统，也可通过开发新型Cas蛋白或对现有蛋白进行优化弥补其限制，提高应用范围和检测方法的适用性。（4）虽然有研究提出了基于CRISPR的单管检测，但容易造成检测性能降低，因此开发更灵敏的单管反应检测体系是研究趋势。有研究提出了一种能实现稳健CRISPR检测的解决方案[43]，在CRISPR检测中利用CRISPR RNA(crRNA）激活光化学控制，从而使RPA和CRISPR⁃Cas12a检测系统可集成到完全封闭的反应管中。在该检测体系中crRNA被设计为暂时失活，使得RPA反应过程不受Cas12a蛋白切割的影响。RPA反应完成后，在快速光照射下激活CRISPR⁃Cas12a检测系统。这种光控制、全封闭的CRISPR诊断系统避免了污染风险，与传统的单管法相比，灵敏度提高了2个数量级以上。（5）病原体的多重检测对现场筛查、临床诊断等具有重要意义，而目前基于CRISPR的多重检测体系多数是针对病毒核酸，针对食源性致病菌的多重检测体系的研究较少，所以建立针对食源性致病菌的多重体系，对食源性疾病的预防和控制非常关键，可以提供有效的技术手段。

基于CRISPR⁃Cas12a系统的检测技术在保护食品安全中具有广阔应用前景，在保障官兵的健康和作战能力等方面具有重要意义，尤其对特殊环境和战时环境（水、空气和食品）生物安全工作尤为关键[44]。因此，基于CRISPR⁃Cas12a系统的快速、灵敏、简便的检测技术和装备有望成为食源性致病菌检测的强有力工具。

参考文献:

[3]付留杰,何瑛.某战区部队食物中毒回顾性调查[J].职业与健康,2013,29(1):71-72.

[4]佚名.加拿大沙门氏菌疫情或由生鸡肉产品引起[J].食品工业科技,2015,36(14):16.

[5]苏建忠,秦璐,范娟,等.武警某部一起食物中毒的调查分析[J].武警医学,2018,29(2):124-125,129.

[6]杨英.一起金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病事件调查分析[J].临床医药文献电子杂志,2021,8(14):89-91.

[44]孙如宝,李利忠,王强.部队高原驻训的饮食饮水卫生安全保障能力调查[J].军事医学,2016,40(9):751-754.

基金资助:国家重点研发计划重点专项(2023YFC3205800);

文章来源:兰紫舒,陈天姣,李君文,等.CRISPR-Cas12a在食源性致病菌检测中的应用研究进展[J].军事医学,2024,48(06):474-480.