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基于LQ模型的原发性肝癌立体定向放射治疗剂量学实验

2024-06-27 153 上传者：管理员

摘要：目的：探讨肝癌立体定向放射治疗（SBRT）的剂量学效应是否符合线性二次（LQ）模型。方法：选取体外培养的人肝癌细胞株HepG2和Hep3B，给予生物有效剂量（BED）照射（6、8、10、12、14 Gy）。照射分割方式包括单次照射（模拟SBRT）和分次照射3次、5次（模拟IMRT）。检测辐照后存活分数反应不同分割方式的损伤效应；绘制生存曲线，观察不同分割方式对细胞增殖的影响；辐照后细胞划痕实验，观察不同分割方式对细胞侵袭和迁移能力的影响。结果：LQ模型在肝癌SBRT放疗的应用体外验证中出现明显的分离效应。对于HepG2细胞和Hep3B细胞，当BED<12 Gy(α/β=10 Gy)时，不同分割方式在损伤效应、增殖能力、侵袭能力上未显示出明显差异，SBRT符合LQ模型；当BED≥12 Gy时，单次分割相对于多次分割，显示出更高的损伤效应，即SBRT损伤效应高于IMRT。结论：SBRT在肝癌中适用LQ模型具有一定的剂量区间，超过该区间损伤效应高于LQ模型预测结果。

关键词：
剂量分割
立体定向放射治疗
线性二次模型
肝癌
预后
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肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是全球癌症相关死亡的第四大原因，肝癌常规治疗手段包括手术治疗、放疗、化疗等，但预后仍较差[1,2]。HCC发病隐匿，早期无明显的临床表现，多数患者就诊时已处于晚期[3]。传统观念认为肝癌辐射敏感性较低，放疗疗效较差，同时受限于胃肠道等危及器官，放疗反应较重，因此肝癌放疗的进展缓慢[4]。立体定向放射治疗（Stereotactic Body Radiotherapy,SBRT）是一种较新的放射治疗方式，尤其适用于控制腹部和盆腔早期原发性和寡转移癌症[5]。随着SBRT技术的普及，肝癌放疗疗效得到明显提升，贯彻于HCC治疗全分期[6]。然而，SBRT尚缺乏统一、公认的评价标准，经典的线性二次（Linear Quadratic,LQ）模型在SBRT剂量学效应评估上存在较大争议[7,8]。因此，USC和RMR等替代模型及LQL和MLQ等修正模型也被建立起来，然而这些模型并未显示出较LQ模型显著的优越性[9,10,11,12]。本文采用肝癌体外细胞系（HepG2和Hep3B），在不同生物有效剂量（Biological Effective Dose,BED）梯度下，采用不同分割方式，观察肝癌细胞辐射损伤效应、增殖情况及侵袭、迁移能力，为探索LQ模型在SBRT适用性提供临床数据。

1、材料与方法

1.1细胞培养

人肝癌HepG2和Hep3B细胞购于中国科学院细胞库，细胞置于含10%胎牛血清（Vivacell）、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素（Beyotime）的RPMI1640培养基（Hyclone）中，在37℃、体积分数为5%CO2的恒温培养箱（Thermofisher）中培养。细胞呈贴壁生长，每2 d换液一次。当细胞汇合度达到约80%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco）消化传代。

1.2辐照条件

取对数生长期的细胞接种至T25培养瓶（Corning）内，待细胞汇合度达到约80%时，室温下采用VitalBeam直线加速器（Varian）进行6 MV-X线照射：机架0°时治疗床床面源皮距100 cm，培养瓶下垫1.5 cm固体水，照射野40 cm×40 cm，剂量率500 cGy/min，机架角转至180°照射。分别设置BED为6、8、10、12、14 Gy组进行照射，每组分3种分割方式，分别为单次分割、3次分割、5次分割。

1.3辐射剂量的计算

BED计算公式：BED=nd(1+d/α/β)，其中n为分次数；d为每次给予的剂量；α/β为组织特异性常数，肿瘤组织默认值取10。按照BED计算公式计算不同BED分组下不同分割方法单次照射的剂量，结果如表1所示。

1.4克隆形成实验

对数生长期的HepG2和Hep3B细胞分别进行6 MV-X线辐照，辐射剂量按第1.3小节中所述。电离辐射后，消化细胞并记数。取一定数目的细胞接种于60 mm的培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱培养10 d，弃掉培养基，后用PBS(Servicebio）小心冲洗两遍，甲醇（Sigma）固定30 min，用3 mL 8%Giemsa(Beyotime）染色30 min，在显微镜下计数克隆数（显微镜下大于50个细胞的集落为一个克隆）。计算克隆形成率（克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%）以及存活分数（Survival Faction,SF=受照射细胞的克隆形成率/对照组细胞克隆形成率），并绘制生存曲线。

表1不同BED及分次照射方案下的分次剂量（Gy)

1.5细胞增殖检测

将对数生长期细胞制成单细胞悬液，取100µL细胞悬液加于96孔板的孔中（10 000个细胞/孔），每组设置3个复孔，培养24、48、72 h后进行检测，向每孔中加入10µL CCK-8(Beyotime）溶液。将96孔板在37℃培养箱内孵育1 h，用酶标仪（Thermofisher）测定450 nm处的吸光度值，重复实验3次，取平均值，绘制增殖曲线。

1.6体外划痕实验

取对数生长期细胞，以106/mL的浓度接种于6孔板中，培养至细胞长满培养皿底。用无菌200μL枪头在每孔细胞中划出一条等宽直线细痕，制作细胞伤口模型；无菌PBS清洗3次以除去漂浮细胞。此时设为划痕后零时，拍照。继续培养，每隔24 h在显微镜下观察划痕宽度，采并用相机拍照记录。图像使用ImageJ软件处理，以获得0 h培养后（12、24 h）的划痕面积。利用细胞迁移率计算公式[细胞迁移率=（0 h划痕面积-培养后划痕面积）/0 h划痕面积]计算不同分割方式下的细胞迁移率。

1.7统计学方法

数据采用SPSS20.0统计软件分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析方法。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1相同BED在不同分割方式下肝癌细胞辐照后损伤效应和增殖能力

由表2、表3及图1的结果可知，随着照射剂量的增加，不同分割方式下的细胞存活率均呈下降趋势，即表现为剂量依赖性。在BED处于6～10 Gy时，不同分割方式在损伤效应和增殖能力上未显示出明显差异。当BED≥12 Gy时，不同存活曲线趋于分离，单次分割相对于多次分割显示出更高的损伤效应。由图1可知，当BED≥12 Gy时单次大剂量放疗后细胞增殖能力受到更明显的损害。

表2 HepG2接受不同剂量X射线照射后的存活分数（)

表3 Hep3B接受不同剂量X射线照射后的存活分数（)

图1相同BED的情况下，不同分割方式辐照下肝癌细胞的增殖情况（**P<0.01)

2.2相同BED在不同分割方式下肝癌细胞辐照后迁移能力

依据第2.1小节中的结果，当BED≥12 Gy时，单次分割方式造成的细胞损伤效应与其他分割方式产生显著差异。为了探究辐射剂量相同时，不同分割方式是否会对细胞的迁移能力产生不同影响，选择BED=12 Gy进行不同方案照射。由图2、图3的结果可知，辐照后肝癌细胞的迁移能力显著降低。在24、48 h两个时间点，单次分割照射的两种细胞的迁移能力与其他分割方式照射后产生显著差异（P<0.05）。然而，3次分割和5次分割两种方式照射后细胞迁移能力的改变无显著差异（P>0.05）。以上结果说明当BED=12 Gy时，单次大剂量照射对肝癌细胞的迁移能力产生更大的损伤。

图2 BED为12 Gy时，Hep G2接受不同照射方案后的迁移能力（**P<0.01)

图3 BED为12 Gy时，Hep3B接受不同照射方案后的迁移能力（*P<0.05,**P<0.01)

3、讨论

HCC是一种辐射中度敏感的恶性肿瘤，但是由于放疗产生的邻近器官损伤以及全肝对辐射总量的低耐受导致放疗在HCC治疗中的作用受到制约[13]。因此使射线能量集中于肿瘤组织，减少周边正常组织器官的受照剂量，成为拓展放疗在肝癌治疗中应用的有效手段。三维适形放疗[14]、图像引导放疗[15]、呼吸门控[16]等一系列提升放疗精度的手段运用于肝癌治疗都取得较好的临床结果。

随着SBRT技术的出现与进步，更少的照射次数、更好的生物学效应、更高的肿瘤区域剂量以及更少的危及器官损害使得肝癌放疗进入新的时代[17,18]。然而，对于SBRT剂量分割模式的选择仍没有统一的标准，目前已有报告的剂量为24～60 Gy,3～10次[19,20,21]。对于高剂量的照射和低剂量的照射在不同的文献[22,23]报告中都表现出较好的效果。考虑到局部剂量增高可能带来的危及器官损伤增加以及对肝功能的损害，需要建立一种有效的模型评估SBRT治疗肝癌的最佳分割方式。

传统的辐射剂量学模型是基于LQ模型建立的，然而LQ模型在SBRT剂量学评估中是否适用仍存在较大争议[7]。Brown等[8]认为LQ模型应用于较高剂量（<20 Gy）的辐射生物学效应预测仍具有较高的拟合优度。然而有证据表明当单次剂量高于10 Gy时，辐射会诱发较强的间接杀伤效应，包括血管损伤、肿瘤内皮细胞损伤等[24]。显然在上述情况下SBRT的生物学效应是被低估了。同时Kelada等[25]发现缺氧对大分割放疗的杀伤效应影响更为显著，而LQ模型很可能高估了这部分辐射损伤。因此，对于LQ模型是否适用于SBRT以及是否需要探索更好的预测模型应用于SBRT辐射生物学效应的评估，仍需要更多的研究予以论证。

结果表明，在体外实验中，辐射处于低剂量区间（BED为6～10 Gy）时不同分割方式对辐射杀伤效应的影响较小，LQ模型适用于不同分割方式放疗的生物学效应预测。然而当辐射剂量较高（BED≥12 Gy）时，单次大剂量放疗较多次分割放疗产生更高的生物学效应。推测差异效应的产生与单次大剂量放疗造成细胞杀伤机制的差异有关，凋亡以外的细胞死亡方式（包括坏死等）在大剂量放疗中的作用更为显著[26]。由于本研究局限在细胞学层面，可能不能完整反映辐射对肿瘤的杀伤效应，SBRT造成的血管损伤、组织乏氧的影响与SBRT的免疫激活效应的影响都被排除或是低估了，因此需要进一步动物实验以验证和完善此项研究的结论。

参考文献:

[4]中国医师协会肝癌专业委员会精确放疗学组,中国研究型医院学会放射肿瘤学专业委员会肝癌学组,中国研究型医院学会肿瘤放射生物与多模态诊疗专业委员会,等.原发性肝癌放射治疗专家共识(2020年版)[J].临床肿瘤学杂志, 2020, 25(10):935-946.

[6]王锡林,刘娟,曲震.射波刀治疗原发性肝癌的临床研究进展[J].癌症进展, 2020, 18(20):2061-2064.

[13]姆尼热·阿卜力米提,谭遥,伊斯刊达尔·阿布力米提.肝细胞肝癌放射治疗研究进展[J].现代肿瘤医学, 2021, 29(10):1817-1821.

[22]乐紫妤,刘勇.体部立体定向放疗的放射生物学研究进展[J].中华放射肿瘤学杂志, 2018, 27(9):864-868.

[26]万晓莉,兰洁,陈永顺,等.单次大剂量照射对Lewis肺癌移植瘤的放射生物学效应[J].四川大学学报(医学版), 2014, 45(2):179-184.

基金资助:国家自然科学基金(82272131);

文章来源:万福莺,周凌宏.基于LQ模型的原发性肝癌立体定向放射治疗剂量学实验[J].中国医学物理学杂志,2024,41(06):673-677.