西瓜(CitrulluslanatusL.)是葫芦科一年生蔓性草本植物，在全世界各地均有种植。目前西瓜生产受到黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)的严重威胁。CGMMV属于芜菁花叶病毒科烟草花叶病毒属，为正单链线状RNA病毒，病毒粒体为杆状，大小为300nm×18nm[1]。CGMMV主要侵染西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物[2],可通过种子、花粉、土壤、介体、机械接触和水源等多种途径进行传播[3,4]。自1935年至今，已报道CGMMV在全世界30多个国家和地区均有分布[5,6,7]。近年，CGMMV传播速度迅速加快，影响了葫芦科作物尤其是西瓜产业的发展，给商业育种、育苗培育、种子贸易、产品生产和零售等行业带来全球性危害[7]。因此，加强CGMMV的防治，提高西瓜对CGMMV的抗性是我国乃至全球西瓜生产亟需解决的重要问题。

MiroRNAs(miRNAs)是长度为19～25nt调控基因表达的内源小RNA,2002年首次在植物中被报道[8]。MiRNAs可与靶mRNA的3′-UTR特异性配对，引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，进而实现对靶基因的转录后调控。miRNAs在植物生长发育及抗逆应答中发挥重要的作用[9]。逆境条件下，植物通过调控miRNAs的表达进一步作用于相应的靶基因以提高植物对胁迫的抗性[10]。MIR319是植物中一类保守的miRNA家族，主要调节靶基因TCP和MYB转录因子的表达[11]。MIR319及靶基因可调节植物叶片发育[12]、花器官发育[13]、次生细胞壁生物合成[14]、细胞增殖[15]及根结发育[16]等生物学过程。

此外，MIR319及靶基因调控植物对生物胁迫的应答过程。在根结线虫(rootknotnematode,RKN)的胁迫下，番茄miR319/TCP4调节叶片茉莉酸(jasmonicacid,JA)合成基因的表达和内源激素JA的水平，进而调控对RKN的抗性[17]。棉花miR159-MYB、miR319-TCP4和miR167-ARF8在RKN胁迫下的表达水平表现为负调控，说明miRNAs介导的基因调控参与棉花对RKN的胁迫应答[18]。水稻齿叶矮缩病毒(Riceraggedstuntvirus,RRSV)侵染水稻可诱导miR319的表达，抑制靶基因TCP2的表达，使内源激素JA水平降低，促进病毒侵染和症状发展[19]。此外，miR319a可靶向与马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)相互作用的下游赤霉素(gibberellin,GA)信号转导，参与GA的信号转导过程[20]。但目前关于miR319及靶基因在西瓜CGMMV胁迫应答中的作用尚不明确。

本研究前期通过对CGMMV侵染前后的西瓜材料JJZ-M进行miRNAs高通量测序，鉴定获得了MIR319家族的3个成员，miR319、miR319a及miR319a-3p;其中miR319在CGMMV侵染后呈现抑制表达，而miR319a在CGMMV侵染后呈现诱导表达[21]。为进一步明确MIR319在CGMMV胁迫应答中的作用，本研究从西瓜材料JJZ-M中分离并克隆MIR319家族成员的前体基因并对其进行系统进化分析，分析其启动子区的顺式作用元件；对MIR319的靶基因及剪切位点进行鉴定，对靶基因所编码蛋白进行生物信息学分析；利用转录组测序(RNA-Seq)及实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)对靶基因在CGMMV不同侵染时间的表达进行分析，旨在为进一步了解MIR319家族成员及靶基因对CGMMV胁迫应答的作用机制奠定基础。

1、材料与方法

1.1植物材料

试验材料为西瓜的高代自交系材料JJZ-M,来源于浙江省农业科学院蔬菜研究所。55℃温汤浸种30min后，28℃恒温箱催芽24h,待种子露白后播种，在植株两片真叶期进行CGMMV人工摩擦接种。取保存的发病叶片和磷酸盐缓冲液，用研钵研磨成糊状病毒汁液用于接种。分别于接种0h(CK)、48h、25d取样，各取3株混成一个样品重复进行RNA-Seq,RNA-Seq为1个生物学重复。

1.2MIR319家族前体基因预测及分子克隆

利用Blastn(E-value=1e-2)将MIR319家族3个成员(miR319、miR319a及miR319a-3p)的成熟序列与西瓜基因组数据库(http://cucurbitgenomics.org/organism/1)进行比对，获得与MIR319家族成员成熟序列完全匹配的基因组序列。截取MIR319两端150nt的核苷酸序列，采用mfold在线软件进行二级结构分析[22]。若其存在完整的茎环结构且成熟序列完全位于3′或5′端，则预测该茎环结构对应的核苷酸序列为MIR319的前体基因Pre-MIR319。

根据Pre-MIR319茎环结构的基因序列，设计特异性引物(F:5′-AGAGCTTTCTTCAGTCCAC-3′;R:5′-GGAGCTCCCTTCAGTCCAA-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL,包含2μLDNA(50ng·μL-1)、10μL2×TSINGKEMasterMix、上游和下游引物(10μmol·L-1)各0.5μL、7μLddH2O。PCR反应程序为：94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,33个循环；72℃延伸8min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.3MIR319前体基因序列及成熟序列比对及系统进化分析

提取miRbase22.0数据库[23]中35个物种的116条miR319的前体序列，利用MEGA5.1软件采用Neighbor-Joining法构建西瓜Pre-MIR319与其他物种miR319前体基因的系统进化树。此外，选取来自不同物种的成熟miR319序列，与西瓜MIR319成熟序列进行序列比对和系统进化分析。

1.4MIR319前体基因启动子区顺式作用元件分析

提取西瓜Pre-MIR319上游1500bp的序列，利用PlantCARE软件[24]对其所包含的顺式作用元件进行预测和分析。

1.5MIR319靶基因预测及相关生物学分析

根据前期降解组测序的结果(CGMMV处理前后的叶片混样，1个生物学重复),对MIR319的靶基因及其靶切割位点进行分析。利用ScanProsite对靶基因编码蛋白质的结构域进行分析；ProtParam对靶基因编码蛋白的氨基酸数目、相对分子量、理论等电点进行分析；TMHMM预测靶基因编码的蛋白质是否含有跨膜结构域；WolfPSORT在线软件对靶基因的亚细胞定位进行预测。

1.6转录组测序(RNA-Seq)及qRT-PCR分析靶基因在CGMMV不同侵染阶段的表达

根据本研究前期RNA-Seq的结果，获得MIR319的靶基因在CGMMV不同侵染阶段(0h、48h和25d)的表达，明确MIR319与靶基因的靶调控关系。此外，进一步利用qRT-PCR分析MIR319靶基因在CGMMV不同侵染阶段(0h、48h和25d)的表达。利用FastKingRTKit[天根生化科技(北京)有限公司]将约2μg总RNA反转录成cDNA,以TUA作为内参基因。qRT-PCR使用TransStartTopGreenqPCRSupermix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司),在StepOnePlusReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems,美国)中完成。反应程序：95℃预变性30s,95℃变性5s,55℃退火15s,72℃延伸10s,40次循环，3次生物学重复。采用2-ΔΔCT法[25]计算基因相对表达量。所用引物及序列见表1。

表1引物及序列

2、结果与分析

2.1MIR319家族成员鉴定及表达分析

根据前期对CGMMV侵染前后的西瓜叶片的miRNAs高通量测序结果[21]。在两个文库中共获得3个MIR319家族成员，miR319、miR319a及miR319a-3p。其中，在CGMMV侵染25d后miR319呈现抑制表达，而miR319a呈现诱导表达，miR319a-3p呈现下调表达(表2),说明MIR319家族成员对CGMMV的胁迫呈现不同的响应模式。

表2CGMMV胁迫下MIR319家族成员鉴定及表达分析

2.2MIR319家族前体基因预测及克隆

分别将MIR319家族的3个成员，miR319(TTGGACTGAAGGGAGCTCC)、miR319a(CTTGGACTGAAGGGAGCTCC)及miR319a-3p(TTGGACTGAAGGGAGCTCCC)的成熟序列与西瓜基因组数据库(http://cucurbitgenomics.org/organism/1)进行Blast序列比对。获得与miR319成熟序列完全匹配的4条基因组序列，包括Chr1:1904345..1904363、Chr1:6347848..6347866、Chr5:29773551..29773569和Chr7:6929678..6929696;获得与miR319a成熟序列完全匹配的3条基因组序列，包括Chr1:1904344..1904363、Chr5:29773551..29773570及Chr7:6929678..6929697;获得与miR319a-3p成熟序列完全匹配的2条基因组序列，包括Chr1:1904345..1904364及Chr5:29773550..29773569。其中仅Chr1:1904345..1904363(Chr1:1904344..1904363;Chr1:1904345..1904364)及其上、下游序列(各150bp)能够形成完整的茎环结构，说明miR319、miR319a及miR319a-3p的成熟miRNA序列来源于同一个前体基因Pre-MIR319。以西瓜基因组DNA为模板对Pre-MIR319进行PCR扩增(图1)。通过测序分析，Pre-MIR319的前体基因长度为170bp,可形成稳定的茎环结构(图2)。

图1Pre-MIR319PCR扩增

2.3MIR319家族成熟序列的比对及前体基因系统进化分析

选取miRbase22.0数据库中10个物种的10条成熟miR319序列，与西瓜MIR319成熟序列进行序列比对和系统进化分析。序列比对显示，MIR319成熟体序列在5′端第2～第14位以及16～20位碱基具有较高的保守性，而在5′端第1、第15、第21、第22位碱基存在差异(图3)。这些碱基差异可能使不同物种的MIR319成员作用于不同的靶基因，进而产生不同的功能。选取miRbase22.0数据库中35个物种的116条MIR319前体序列，与西瓜Pre-MIR319一起通过MEGA5.1进行系统进化分析，可将这些MIR319前体序列分为四大分支。第一分支含有36个成员，第二分支含有32个成员，第三分支含有18个成员，第四分支含有30个成员，表明MIR319在不同物种间的进化关系上存在差异性。其中西瓜Pre-MIR319位于第一分支，亲缘关系与马铃薯miR319a的前体基因(MI0025952)最近(图4)。

图2Pre-MIR319形成的茎环结构及MIR319家族成员的成熟序列

2.4Pre-MIR319启动子区顺式作用元件分析

对Pre-MIR319上游1500bp启动子区所含的顺式作用元件进行分析，发现其含有多个顺式作用元件(图5)。包括基因启动子和增强子区的顺式作用元件(TATA-box和CAAT-box)、光响应元件(TCCC-motif、chs-CMA1a、chs-CMA2a、Ⅰ-box、Box4、GATA-motif和GT1-motif)、赤霉素响应元件(P-box和TATC-box)、乙烯响应元件(ERE)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、类黄酮生物合成基因调控元件(MBSI)、分生组织表达响应元件(CAT-box)以及MYB和MYC等顺式作用元件。

图3MIR319成熟序列比对

图4不同物种MIR319前体基因系统进化分析

2.5降解组测序鉴定MIR319家族成员的靶基因

由表3可知，降解组测序对MIR319家族成员的靶基因进行鉴定，获得miR319及miR319-3p的4个靶基因，分别为Cla002428、Cla013523、Cla019567和Cla023342,均注释为TCP转录因子；获得miR319a的2个靶基因，Cla013523及Cla013668,其中Cla013523注释为TCP转录因子，Cla013668注释为MYB转录因子。进一步分析MIR319对靶基因的剪切位点，发现miR319、miR319a及miR319-3p剪切靶基因的位点均位于其成熟序列5′端的第10位碱基。此外，miR319及miR319a-3p剪切靶基因的位点分别位于Cla002428、Cla013523、Cla019567和Cla023342的第1067、731、1196和1085位碱基；miR319a剪切靶基因的位点分别位于Cla013523及Cla013668的第732及952位碱基(表3、图6)。

2.6靶基因生物信息学分析

利用ScanProsite对靶基因编码蛋白的结构域进行分析，其中Cla002428、Cl013523、Cla019567和Cla023342均含有TCP结构域，其位置分别位于39～97、52～110、95～153和44～102位氨基酸，而Cla013668在33～85位及86～140位氨基酸均含有HTH_MYB结构域(图7)。ProtParam对靶基因编码蛋白的氨基酸数目、相对分子量、理论等电点进行分析，靶基因编码氨基酸数目为319～554aa、相对分子量为34.94～61.21kDa、理论等电点为5.29～7.80。利用WolfPSORT在线软件对靶基因进行亚细胞定位预测，其中Cla013523、Cla019567和Cla013668定位于细胞核内，Cla002428和Cla023342定位于细胞核和细胞质中，TMHMM预测显示靶基因编码的蛋白质均不含有跨膜结构域(表4)。

表3降解组测序获得MIR319家族成员靶基因

图5Pre-MIR319启动子区顺式作用元件分析

表4MIR319靶基因生物信息学分析

2.7MIR319靶基因的表达分析

根据CGMMV侵染前后西瓜叶片的转录组测序结果，对MIR319靶基因的表达进行分析。在CGMMV侵染48h后Cla002428(TCP)、Cla023342(TCP)及Cla013668(MYB)呈现上调表达；Cla013523(TCP)及Cla019567(TCP)呈现下调表达。此外，MIR319所有靶基因在CGMMV侵染25d后均呈现下调表达，其中Cla013523(TCP)及Cla019567(TCP)呈现显著下调(表5)。根据前期miRNA高通量测序，MIR319家族成员(miR319、miR319a及miR319a-3p)在CGMMV侵染前后的表达结果(表2),即miR319及miR319a-3p在CGMMV侵染25d后分别呈现显著下调及下调表达，而miR319及miR319a-3p的靶基因Cla002428(TCP)、Cla013523(TCP)、Cla019567(TCP)及Cla023342(TCP)在CGMMV侵染25d后呈现下调表达；miR319a在CGMMV侵染25d后呈现显著上调表达，其靶基因Cla013523(TCP)在CGMMV侵染25d表现为显著下调表达，另一个靶基因Cla013668(MYB)在CGMMV侵染25d后表达量无差异。

表5RNA-Seq分析MIR319靶基因在CGMMV不同侵染阶段的表达

图6降解组测序鉴定MIR319剪切靶基因的位点

图7ScanProsite预测MIR319靶基因编码蛋白结构域

图8qRT-PCR分析MiR319的靶基因在CGMMV不同侵染阶段的表达

此外，利用qRT-PCR对MIR319靶基因在CGMMV不同侵染阶段的表达进行分析，其中Cla013523(TCP)和Cla019567(TCP)在CGMMV不同侵染阶段的表达模式一致，即与CK相比，Cla013523(TCP)和Cla019567(TCP)在CGMMV侵染48h和25d后呈现持续下调表达；Cla002428(TCP)和Cla023342(TCP)在CGMMV不同侵染阶段的表达模式一致，即与CK相比，Cla002428(TCP)和Cla023342(TCP)CGMMV侵染48h后呈现上调表达，在CGMMV侵染25d后呈现下调表达；与CK相比，Cla013668(MYB)在CGMMV侵染48h和25d后呈现上调表达(图8)。qRT-PCR结果表明，绝大部分靶基因在CGMMV不同侵染阶段的表达与转录组测序一致。上述转录组测序结果及qRT-PCR结果均表明，miR319a对靶基因Cla013523(TCP)的表达表现为负调控。

3、讨论

目前，参与植物对CGMMV胁迫应答的miRNAs越来越多地被挖掘出来。对接种CGMMV前后的黄瓜进行miRNAs高通量测序，获得多个参与CGMMV胁迫应答的新的保守的miRNAs成员[26]。本研究前期通过对CGMMV侵染前后的西瓜叶片进行miRNAs高通量测序，获得一些参与CGMMV胁迫应答的miRNAs,如miR164b及miR319[21]。miR164b通过靶向NAC转录因子参与西瓜对CGMMV的胁迫应答[27]。研究表明，miR319在植物对生物胁迫应答中发挥重要的作用[17,18,19,20]。水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)侵染可诱导miR319的表达，抑制靶基因TCP21的表达，JA水平降低，表明RRSV侵染可诱导miR319介导的防御机制[19]。因此，进一步对miR319及靶基因进行相关生物学分析可为揭示miR319对CGMMV胁迫应答的分子机制奠定基础。本研究对鉴定到的西瓜MIR319前体基因Pre-MIR319进行序列分析，显示Pre-MIR319长度为170bp,可形成稳定的二级发夹结构。西瓜MIR319成熟序列在5′端第2～第14位碱基具有较高的保守型，可保证MIR319对靶基因的精确切割。对MIR319前体序列进行系统进化分析，显示Pre-MIR319进化关系与马铃薯miR319a的前体基因(MI0025952)最近。

研究表明miR319与其他miRNAs存在相互作用。植物miR159主要靶向MYB转录因子，miR319主要作用于TCP转录因子。研究发现miR319家族与miR159家族关系密切，它们的靶基因在21个核苷酸中有17个具有共享序列，miR159和miR319的功能特化是通过表达差异和序列差异实现的[28]。本研究中西瓜miR319的2个靶基因Cla013523和Cla019567,同时也作为miR159的靶基因，受到miR159和miR319的共同调控。除此之外，miR319与miR172也存在相互作用，miR319前体异常的长折叠结构与miR172的加工有关[29]。

MIR319和TCP的mRNA几乎互补的核苷酸序列构成了基因调控的分子机制[30]。MIR319单核苷酸突变可降低其靶向5个TCP基因的能力[13]。本研究中，西瓜MIR319家族的3个成员靶向4个TCP转录因子基因，1个MYB转录因子基因，剪切位点在MIR319家族成员成熟序列5′端第10位碱基。根据转录组测序的结果，仅miR319a与靶基因Cla013523(TCP)的表达表现为负相关。分析其原因主要是同一个靶基因受不同miRNAs的调控，如Cla019567(TCP)除受miR319和miR319a-3p的调控，还受miR159的调控，调控机制较杂，需进一步研究。

研究发现miR319的靶基因TCP调控JA的生物合成及信号转导过程。RRSV侵染一方面诱导miR319的表达，抑制TCP21的表达，另一方面水稻内源JA水平降低，表明RRSV可诱导JA介导的防御机制，调控水稻对RRSV的抗性[19]。本研究通过对Pre-MIR319启动子区的顺式作用元件进行分析，发现其启动子区含有茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,说明西瓜MIR319也可能通过参与JA介导的防御反应调控西瓜对CGMMV的胁迫应答。

4、结论

本研究获得西瓜MIR319家族3个成员的前体基因序列，系统进化分析将多个物种的miR319前体基因分为四个分支。Pre-MIR319启动子区含有多个参与植物生长发育及胁迫应答的顺式作用元件，降解组测序获得MIR319家族3个成员的5个靶基因，其中4个为TCP转录因子，1个为MYB转录因子。转录组测序及qRT-PCR对MIR319的靶基因在CGMMV胁迫下的表达进行分析，miR319a对靶基因Cla013523(TCP)的表达表现为负调控。本研究明确了MIR319家族成员及其靶基因对CGMMV的应答模式，为西瓜CGMMV抗性基因(因子)获得及分子机理研究奠定了基础。

参考文献：

[27]孙玉燕,何艳军,牛晓伟,崔狄,范敏.西瓜miR164b靶基因鉴定及其对黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染应答的分析[J].园艺学报,2018,45(3):482-492.

孙玉燕,张慧青,范敏,何艳军,郭平安.西瓜CGMMV胁迫下MIR319家族成员及靶基因的鉴定分析[J].核农学报,2021,35(05):1048-1059.