随着对虾集约化养殖的快速发展，为追求快速生长和高产量，采用高密度养殖和过量投饲的方式极易导致养殖环境中残饲、粪便等大量积累，经微生物氨化分解后，养殖水体中氨氮(NH+4-N)、亚硝酸盐氮(NO-2-N)污染加重，并伴随硫化物的积累和池底还原性的增强，这些污染物不仅严重损害水产动物的生理代谢，还会影响其生存和生长，极易诱发病害发生，造成严重的经济损失[1-2];同时水产养殖尾水的排放，也会对水域生态系统和水生生物安全造成潜在的威胁[3-4]。因此，采取有效方法消除水产养殖环境中的氮、硫污染物对于保障水产养殖业绿色健康发展至关重要。微生物脱氮脱硫已成为水产养殖环境净化的主要技术手段，目前通过筛选具有脱氮脱硫能力的高效有益菌株，构建脱氮脱硫复合菌已成为水产养殖微生态控制研究的重要方向[4-6]。已有研究显示异养硝化-好氧反硝化细菌(Heterotrophic nitrifying-aerobic denitrification, HN-AD)和硫氧化菌(Sulphur-oxidizing bacteria, SOB)具有高效去除养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮和硫化物的能力而受到广泛关注[5,7-9]。目前HN-AD和SOB菌株的研究主要集中于生活污水和工业废水方面，而从水产养殖环境中分离进行原位脱氮脱硫应用的研究较为匮乏[10-12];鉴于菌株的生态适应性和潜在的致病风险等因素，从水产养殖环境中分离筛选得到高效脱氮、脱硫益生菌株，并进行“土著土用”具有重要意义。然而，在脱氮脱硫菌株和复合菌的研究应用中多集中于解析菌株的最适环境条件，较少考虑到影响菌株氮、硫去除能力的主要环境因素[4,7,13]。水产养殖环境温度、pH、盐度等关键因素不仅影响菌株的生理活性和代谢过程，还在很大程度上决定了其对污染物的去除效率[11]。因此，为全面提升益生菌株脱氮脱硫的效率，有针对性地识别影响益生菌株的关键环境因素显得尤为重要，Plackett-Burman试验作为能够快速地从诸多因素中筛选出主要影响因子的经典试验设计方法，已成为筛选影响微生物生长和代谢的主要环境因素优选的重要技术方法[14]。

本研究利用从对虾养殖环境中筛选出的高效HN-AD菌和SOB菌，构建脱氮脱硫复合菌，分析了不同环境因素对复合菌的脱氮脱硫效能的影响，采用Plackett-Burman试验设计，探究了影响复合菌脱氮脱硫效率的主要环境因素，解析了复合菌对水产养殖尾水的降解效果，以期通过结合实际养殖环境条件，更有针对性地对复合菌进行选择和应用，从而为水产养殖环境污染控制与绿色水产养殖业的健康发展提供有力的技术支撑。

1、材料与方法

1.1 试验材料

使用的2株HN-AD菌(HHVEN1、SDVEA2)和3株SOB菌(GHWS3、GHWS5、SDSWS8)均保存于中国海洋大学水产动物环境生理学研究室菌种库。经16S rDNA同源性和生理生化特性分析，菌株HHVEN1鉴定为太平洋杨慧芳氏菌(Yangia pacifica)、菌株SDVEA2为烟草谷氨酸杆菌(Glutamicibacter nicotianae)、菌株GHWS3为假单胞菌(Pseudomonassp.)、菌株GHWS5为鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumssp.)、菌株SDSWS8为海杆菌(Marinobactersp.)。

所用培养基如下：

硝化培养基：(NH4)2SO40.096 g、C6H12O60.25 g、K2HPO40.050 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FePO4·4H2O 0.01 g、抽滤海水(pH 7.5)1 000 mL。

反硝化培养基：NaNO20.10 g、C6H12O60.25 g、K2HPO40.050 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FePO4·4H2O 0.01 g、抽滤海水(pH 7.5)1 000 mL。

硫化物培养基：Na2S·9H2O 0.75 g、C6H12O60.25 g、NaHCO32.0 g、K2HPO40.1 g、KNO30.072 g、MgCl2·6H2O 0.2 g、FePO4·4H2O 0.01 g、抽滤海水(pH 7.5)1 000 mL。

培养基上方封0.5～1.0 cm液体石蜡，L-半胱氨酸盐酸盐和刃天青分别作为除氧剂和氧气指示剂[15],灭菌后的培养基于厌氧培养箱中冷却静置待培养基无色后使用。

所有培养基于115 ℃灭菌30 min, 2216E培养基(青岛海博生物科技限公司)于121 ℃灭菌15 min, (NH4)2SO4、Na2S·9H2O使用0.22 μm的滤膜过滤灭菌。所有试验均设置3个平行组。

1.2 菌株相容性试验

采用牛津杯法测定菌株间的拮抗作用[16]。在28 ℃、160 r/min条件下，将备选的HN-AD菌和SOB菌于2216E液体培养基中活化24 h。HN-AD菌的100 μL菌悬液均匀涂布在2216E固体培养基后放置无菌的牛津杯，然后向牛津杯中加入100 μL SOB菌的菌悬液。30 ℃条件下培养24～48 h, 观察是否出现抑菌圈。

菌株活化后，从2株HN-AD菌和3株SOB菌中各选一株，按照1∶1的比例进行两两组合，分别为NS1-1(HHVEN1+GHWS3)、NS1-2(HHVEN1+GHWS5)、NS1-3(HHVEN1+SDSWS8)、NS2-1(SDVEA2+GHWS3)、NS2-2(SDVEA2+GHWS5)、NS2-3(SDVEA2+SDSWS8)。菌株离心后用灭菌过滤海水将组合物浓度调整为1.0×108CFU/mL,以1%的接种比例分别接种到硝化、反硝化及硫化物培养基中，28 ℃、160 r/min条件下培养48 h后测定NH+4-N和NO-2-N去除率。于厌氧培养箱中30 ℃静置培养72 h后测定硫化物去除率。筛选NH+4-N、NO-2-N和硫化物去除率最高的复合菌用于后续试验。样品于8 000 r/min离心10 min后取上清液，分别采用海洋监测规范第4部分：海水分析的次溴酸盐氧化法、萘乙二胺分光光度法(GB 17378.4—2007)[17]和水质硫化物的测定亚甲基蓝分光光度法(GB/T 16489—1996)[18]测定NH+4-N、NO-2-N和硫化物浓度。

1.3 单一菌株与复合菌脱氮脱硫能力的比较

将构建的复合菌和单一菌株活化后离心，用灭菌过滤海水将菌浓度调整为1.0×108CFU/mL,以1%的比例分别接种至相应的硝化、反硝化和硫化物液体培养基中，由预试验可知硫化物在试验环境中可能存在氧化问题，为消除误差的影响，硫化物处理组以不接种益生菌组为对照组，后续试验均采取相同的处理方式。于30 ℃、160 r/min培养72 h, 其中硫化物培养基静置培养。每6 h或12 h取1次菌悬液样品，离心取上清液测定NH+4-N、NO-2-N和硫化物浓度。

1.4 复合菌培养条件的优化

1.4.1 不同环境因素对复合菌脱氮脱硫效能分析

通过单因素试验探究不同环境因素对复合菌NH+4-N、NO-2-N和硫化物去除能力的影响。将筛选出的两种高效复合菌组合的所有菌株分别活化24 h后，转移到含有20 mL相应培养基的50 mL锥形瓶/顶空瓶中，保持初始菌浓度为1.0×106CFU/mL。在温度(10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃),pH (6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0),碳氮比(Carbon nitrogen ratio, C/N) (0、2.5、5、10、15、20),盐度(0、5、10、20、30、40)和碳源(无水葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、蔗糖和琥珀酸钠)的不同水平下进行高效复合菌株的测试，其中通过改变碳源含量对C/N进行调整。除试验条件外，其他条件为温度28 ℃、pH=7.5、C/N=5、盐度30、碳源为葡萄糖。培养48 h或72 h后取样，离心取上清液测定NH+4-N、NO-2-N和硫化物浓度。

1.4.2 复合菌脱氮脱硫的主要影响因素分析

为探究复合菌脱氮脱硫的主要环境影响因素，通过Plackett-Burman试验，对影响复合菌NH+4-N、NO-2-N和硫化物去除率的培养条件进行主因素分析。试验设计如表1所示，基于培养条件优化的单因素试验结果，复合菌NS2-2除C/N的-1和1水平分别为2.5和10外，其他环境因素的水平与表1相同。试验数据经软件Design Expert 13.0分析后通过各因素的F值和P值筛选影响复合菌脱氮脱硫能力的主要环境因素。

表1复合菌NS1-1和NS2-2Plackett-Burman设计的 各因素与水平

1.5 复合菌对水产养殖尾水脱氮脱硫效果分析

1.5.1 复合菌在养殖尾水中共存性分析

菌株活化24 h后，离心收集菌株并用灭菌过滤海水调整菌株浓度。将复合菌和单一菌株分别接种于灭菌的实际养殖尾水中，保持初始菌浓度为1.0×106CFU/mL。每12 h取样一次，分别取100 μL样品，经无菌海水稀释后，均匀涂布于2216E固体培养基，30 ℃恒温培养箱中培养48 h, 计数菌落数。

1.5.2 复合菌对水产养殖尾水的降解效果

养殖尾水和底泥取自凡纳滨对虾养殖池塘，4 ℃保存备用。经检测，养殖尾水pH为8.02±0.04,盐度为25,将尾水和底泥以9∶1的比例混合，形成尾水-底泥混合物，其TN、NH+4-N、NO-2-N和硫化物质量浓度分别为18.62 mg/L、8.23 mg/L、7.90 mg/L和122.16 mg/L。菌株活化24 h后离心，用灭菌过滤海水将构建的复合菌浓度调整为1.0×108CFU/mL,以1%的比例接种于100 mL尾水-底泥混合物中，在30 ℃、160 r/min条件下进行培养，定期取样，测定NH+4-N、NO-2-N和硫化物浓度，以非接菌组为对照组。

1.6 数据处理及统计分析

试验结果以3个平行组数据的平均值±标准差(Mean±SD)表示。通过方差齐性检验，验证数据的统计学分析可行性后，进行单因素方差分析和Duncan检验，在P<0.05时考虑有显著性差异。所有数据均采用SPSS 26.0进行统计；Plackett-Burman试验经软件Design Expert 13.0进行数据处理与分析。

2、试验结果

2.1 脱氮脱硫复合菌的构建与筛选结果

菌株相容性试验表明，2株HN-AD菌与3株SOB菌之间均无明显的拮抗作用(图1)。

图1菌株HHVEN1、GHWS3(a)和菌株SDVEA2、 GHWS5(b)间的拮抗试验结果

表2不同复合菌对NH+4-N、NO-2-N和硫化物的去除率

图2 HHVEN1、GHWS3、复合菌NS1-1(a～c)和SDVEA2、GHWS5、复合菌NS2-2(d～f)脱氮脱硫能力比较

2.2 单一菌株与复合菌脱氮脱硫能力的比较

图2表明，单一菌株HHVEN1、GHWS3和SDVEA2、GHWS5对NH+4-N均具有较高的去除效率，在72 h内复合菌NS1-1和NS2-2的NH+4-N去除率分别优于单一菌株(图2a、d);在24 h内，复合菌NS1-1、NS2-2的NO-2-N去除率分别达到94.86%、97.27%,具有比单一菌株更高的NO-2-N去除效率(图2b、e);单一脱硫菌株GHWS3、GHWS5表现出良好的硫化物去除能力，单一脱氮菌株HHVEN1、SDVEA2脱硫效率不佳，而复合菌NS1-1、NS2-2在72 h时硫化物去除率分别为99.31%和98.46%,与单一脱硫菌株相比，复合菌NS1-1和NS2-2具有更快的硫化物去除速率(图2c、f)。

图3不同环境因素对复合菌NS1-1(a)和NS2-2(b) NH+4-N、NO-2-N和硫化物去除率的影响

2.3 复合菌培养条件的优化结果

2.3.1 不同环境因素对复合菌脱氮脱硫能力的影响

如图3所示，复合菌NS1-1、NS2-2在20～35 ℃时，对NH+4-N、NO-2-N和硫化物的去除率均高于70%,30 ℃时达到88%以上；复合菌NS1-1在pH 7.5～8.0内，脱氮脱硫效率均达到91%以上，NS2-2在pH 7.0～8.5时，去除率达到75%以上，在pH=7.5时，3种污染物的去除率分别达到92.15%、96.76%和88.21%;在C/N≥5条件下，复合菌NS1-1、NS2-2的脱氮效率均高于92%,NS1-1脱硫效率在90%以上，而NS2-2在C/N=5时硫化物去除率最高(88.02%),随C/N的升高去除率显著降低。0～30盐度范围内，复合菌NS1-1、NS2-2脱氮效率随盐度的升高呈逐渐上升的趋势，且在20～30时脱氮率均在80%以上，而两种复合菌脱硫效率不受盐度的影响，均在80%以上。以葡萄糖和琥珀酸钠为碳源，复合菌NS1-1和NS2-2的NH+4-N和NO-2-N去除率均高于91%,在葡萄糖为碳源的条件下，复合菌NS1-1和NS2-2硫化物去除率最高，分别为94.46%和86.79%。

2.3.2 复合菌脱氮脱硫的主要影响因素的分析结果

由表3的Plackett-Burman结果可见，复合菌NS1-1的NH+4-N去除率受环境因素影响顺序为：温度>pH>碳源>C/N>盐度，NO-2-N去除率顺序为：C/N>盐度>温度>碳源>pH,硫化物去除率为：pH>碳源>温度>盐度>C/N。复合菌NS2-2的NH+4-N、NO-2-N、硫化物去除率的影响顺序分别为：C/N>pH>盐度>温度>碳源、盐度>碳源>C/N>温度>pH、pH>C/N>盐度>碳源>温度。

2.4 复合菌对水产养殖尾水脱氮脱硫的实际降解效果

如图4a、b显示，复合菌NS1-1(HHVEN1、GHWS3)和复合菌NS2-2(SDVEA2、GHWS5)两种组成菌株在养殖尾水中作用48 h, 其菌浓度均呈现逐渐升高趋势，之后复合菌NS1-1中两种菌株趋于稳定，而复合菌NS2-2中两种菌株表现为下降趋势，复合菌NS1-1、NS2-2组成菌株未表现出较大差异，表现出较好的共存性。

由图4c、d所示，复合菌NS1-1在72 h内，将养殖尾水的NH+4-N、NO-2-N和硫化物质量浓度分别降至1.98、2.04和25.49 mg/L,去除率分别为78.75%、75.09%和79.61%;复合菌NS2-2在72 h内，将NH+4-N、NO-2-N和硫化物质量浓度分别降为1.34、2.87和32.07 mg/L,去除率分别为81.44%、62.68%和72.64%。对水产养殖尾水表现出高效脱氮脱硫效能。

3、讨论

3.1 脱氮脱硫复合菌的构建

随着水产养殖业快速发展，水产养殖环境中NH+4-N、NO-2-N、硫化物污染已成为诱发病害的重要因素。目前单一菌株的微生态脱氮或脱硫方面已取得一些研究成果[7,19-20]。但是复合菌具有更高效的脱氮脱硫效果，如Feng 等[21]构建的复合菌能够去除水产养殖水体中88.7%的总氮和71.3%的硫化物，且效果明显优于单一菌株；Watsuntorn 等[22]研发的复合菌消除废水中的氮、硫污染物，远超单一菌株脱氮脱硫的效果。本研究选取两株HN-AD菌和三株SOB菌，经配伍筛选获得的复合菌NS1-1和NS2-2具有高效的NH+4-N、NO-2-N和硫化物去除能力，且脱氮脱硫效果均优于单一菌株，这与上述研究结果类似，由此说明复合菌在脱氮脱硫方面具有明显的优势和应用潜力，是消除水体氮、硫污染的重要技术手段，复合菌NS1-1和NS2-2能否应用于水产养殖尚需进一步研究证实。

3.2 不同环境因素对高效复合菌脱氮脱硫效能分析

菌株培养条件的优化是菌株发酵生产和高效应用的重要前提。已有研究指出在对虾养殖环境中，温度通常在18～30 ℃、盐度在0～35、pH在7.0～9.0的范围内波动，C/N通常低于5[19,23-24]。为提高复合菌在水产养殖环境中的应用范围，要求复合菌在温度、盐度、pH、C/N等环境因素的适应方面与水产养殖环境相符为宜。养殖环境的波动性往往限制了菌株脱氮脱硫潜能的充分发挥，这主要是因为不同菌株对环境的适应性存在差异，仅通过培养条件的优化难以全面考虑这些差异。如Huang 等[4]报道复合菌MCH与MAH在温度20～30 ℃,C/N 15～20,蔗糖为碳源的条件下具有较强的脱氮能力，但当盐度在2～50的范围内变动时，其氮去除率下降至70%以下，这说明在复杂多变的养殖环境下，单纯依赖培养条件的优化来评估菌株的适应性是不够的。本研究采用Plackett-Burman试验方法，探究了不同环境因素对复合菌NS1-1和NS2-2氮、硫去除能力的差异化影响。结果显示，同一环境因素对不同复合菌氮、硫去除能力的影响不尽相同，如C/N对复合菌NS1-1的NO-2-N去除率有显著影响，而对复合菌NS2-2的NH+4-N去除率有显著影响。这是因为菌株对不同的环境因素具有独特的适应性[25-27],而这种适应性主要受到复合菌间协同作用、竞争代谢等多种复杂机制的综合影响，使得菌株在不同环境条件下展现出独特的适应策略[25-26]。本研究的复合菌不仅具有高效的氮、硫去除能力，对养殖环境理化因子的波动也表现出卓越的调整和适应能力。

表3复合菌NS1-1和NS2-2的Plackett-Burman试验各因素显著性分析

图4复合菌NS1-1、NS2-2在养殖尾水中的菌株丰度变化(a、b)与降解效果(c、d)

3.3 复合菌对水产养殖尾水脱氮脱硫的降解效果

已有研究指出群体感应(Quorum Sensing, QS)是细菌用来响应细胞群体密度波动的细胞间通信方式。细菌能够通过QS系统分泌和感应特定的信号分子来调控相关基因的表达水平，进而影响硝化、反硝化和硫氧化等过程[28-29]。这一机制揭示了不同菌株之间良好的共存性对于高效脱氮和脱硫过程的重要性。例如，Huang 等[23]的研究展示了菌株间良好共存性的重要性，其构建的复合菌组合MCH、MAH和MAC,因其出色的共存性和高效协同作用，在氮去除效率上显著高于单一菌株。本研究也进一步证实了这一点，复合菌NS1-1与NS2-2在水产养殖尾水中72 h内不仅表现出良好的菌株共存性，而且具有显著的NH+4-N、NO-2-N和硫化物去除效果，这表明良好的共存性促进了菌株之间的协同作用，从而提高了脱氮和脱硫的效率，也进一步证明了菌株间良好的共存性是提升菌株氮、硫去能力的关键条件。

评估复合菌在实际养殖环境中的氮、硫去除效果，是决定其应用潜力的关键。然而，实际养殖环境错综复杂，离子平衡和微生物群落的动态变化给微生物的定殖和存活带来了挑战[29]。实际应用表明，利用土著菌构建的复合菌在复杂多变的养殖环境中能够展现良好的氮、硫去除效果[4,30];另有研究指出向养殖环境中引入一定数量的复合菌可以有效改变原生环境中微生物的群落结构和丰度，一旦形成优势菌群，还能促进原生环境中的氮、硫代谢强度，从而在养殖环境内形成良性循环，进一步改善水质条件[31-32]。本研究构建的复合菌NS1-1和NS2-2在实际养殖环境下依然具有显著的脱氮与脱硫效能。外源菌被引入新环境能否适应和存活并发挥效能是一个必须重视的科学问题，在大力倡导水产养殖绿色发展的大背景下，应尽量使用“土著菌”构建的微生态制剂。这不仅能增强益生菌的环境适应性，还能提升脱氮、脱硫效率，对于维护水产养殖环境的清洁具有重要的意义。

4、结论

本研究利用自对虾养殖环境中筛选出的异养硝化-好氧反硝化菌(HHVEN1和SDVEA2)和硫氧化菌(GHWS3和GHWS5),成功构建了两种高效脱氮脱硫复合菌NS1-1和NS2-2,通过Plackett-Burman试验方法，建立了识别影响益生菌株发挥效能的关键环境因素的技术方案；并发现复合菌NS1-1和NS2-2在水产养殖尾水中具有良好的共存性和高效的脱氮脱硫能力。研究认为水产养殖复合菌微生态控制技术，必须明确哪些环境因素显著影响复合菌的氮、硫去除能力，要注重复合菌使用的环境条件，以全面提升复合菌消除污染物的效率。本研究通过Plackett-Burman试验的方法，精确识别了影响益生菌株发挥效能的关键环境因素，为水产养殖环境清洁建立了新的技术方案。

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文章来源:李梓路,刘畅,李腾,等.对虾养殖环境脱氮脱硫复合菌的构建与效能分析[J].渔业现代化,2024,51(05):18-27.