塑料是一种人工合成的有机高分子材料,具有化学性质稳定、制备成本低廉等特点，被广泛应用于日常生活和工业生产中。统计表明，每年有470万吨～1280万吨塑料垃圾随地表径流汇入海洋环境[1]。目前海洋中漂浮的塑料碎片数量已超过5万亿个，无疑给海洋环境造成了极大压力，随之而来的污染问题也越来越受关注[2]。天然海洋环境中，塑料在水流冲刷和紫外光辐射等因素影响下，会破碎成尺寸不等的塑料颗粒[1]。研究显示，当塑料颗粒破碎为粒径小于5 mm的微塑料（microplastics,MPs）和小于100 nm的纳米塑料（nanoplastics,NPs）时，更容易被浮游动物、双壳贝类和鱼类等海洋生物吞食，导致生物器官衰竭、生长发育受限等毒性效应[3]，甚至危害生物体生命安全和子代繁殖[4]。大量研究发现，海洋微塑料污染还会加剧海洋动物的神经毒性效应，诱导桡足类动物产生严重的氧化应激效应[5]；通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性[6]，影响血蛤体内的神经递质含量[7]；对于鱼类而言，这种污染会导致其神经元变性和细胞质空泡化，使鱼类脑组织受损，进而引发一系列的异常行为[8]。此外，更值得注意的是，由于NPs具有高比表面积和疏水特性，常作为其他有毒污染物的载体，这会对海洋生物神经系统产生复合毒性效应[7]。

聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate,PET）是饮料和食品领域中应用最广泛的包装材料之一。据统计，PET是海滩上最常见的塑料废弃物[9]，在污水和海洋沉积物里的微塑料中占比高达78%[10]。然而，目前PET塑料对海洋生物及其栖息环境的生态风险研究仍未得到充分关注。

多巴胺（dopamine,DA）作为生物中枢神经系统中重要的神经递质之一，在机体运动行为调节和控制方面起着重要作用[11]。因此，DA浓度的异常变化可被用于污染物对海洋生物神经毒性的早期筛查。电化学传感法是一种反应迅速、准确度高的检测分析方法，并具有操作简便且便于小型化的优势，适用于生物体内外DA的实时监测[12-13]。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（pheochromocytoma cells,PC 12）作为一种常用的神经毒性模式生物，已被广泛应用于海洋毒素污染物的神经毒性研究[14]。本研究以PC 12细胞系为模型，应用类羟化酶电化学传感法和试剂盒法，对不同老化程度PET影响下PC 12的DA释放量以及氧化应激水平进行检测分析，并评价PET纳米塑料对海洋生物的神经毒性风险，为评估其海洋生态风险提供科学依据。

1、材料与方法

1.1老化PET的制备与表征

本研究使用的PET纳米塑料粒径为100 nm，购自江苏智川智能科技有限公司。将25 mg/mL PET悬浮液置于10 mL带盖玻璃瓶中，暴露于紫外灯（20 W/m2和38 W/m2）下，并伴随剧烈搅拌，以模拟海洋环境中PET经水流冲刷所导致的物理磨损状况。在光老化0、6 h、12 h、24 h、48 h时分别对PET进行取样，过滤、烘干处理后备用。通过扫描电子显微镜（SEM,Hitachi S 4800,日本日立公司）、纳米粒度及Zeta电位分析仪（ZS 90,中国马尔文帕纳科公司）和傅里叶变换近红外光谱仪（FTIR,MPA,德国布鲁克公司）对不同老化时间下PET的形貌粒径、表面电荷和化学结构进行表征分析。依据Gewert等报道的公式[15]，对紫外线辐照强度与模拟自然环境中暴露天数进行等效换算：

依次将本模拟实验中的紫外线辐照强度与持续暴露时间（6 h、12 h、24 h、48 h）代入公式计算，换算得到自然环境中的平均辐照老化时间为58 d、129 d、258 d、516 d。最后，将未经紫外线照射的初始PET样品记作PET-0，将经紫外照射6 h、12 h、24 h、48 h的老化PET样品分别记作PET-6 h、PET-12 h、PET-24 h、PET-48 h。

1.2细胞培养及活力测定

高分化PC 12购自上海莼试生物技术有限公司。细胞培养基成分为90%RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）、10%胎牛血清（德国PAN公司）和1%青链霉素溶液（北京索莱宝科技有限公司）。采用CO2浓度为5%的37℃培养箱（BB 150，美国Thermo公司）完成细胞培养实验。利用酶标仪（INFINITE F 50，瑞士TECAN公司），采用Cell Counting Kit-8试剂盒（CCK-8,美国APE×BIO公司），按照说明书对PC 12的细胞活力进行测试。

1.3类羟化酶电化学传感法测定DA释放量

将处于对数生长期的PC 12接种到24孔板中，培养24 h。待PC 12贴壁后，向实验组分别依次加入含有一系列不同浓度PET和2,4-二氨基丁酸的培养基，并以加入等体积的培养基为空白对照组，同步培养24 h。随后离心弃去培养基，再用无菌生理盐水洗涤细胞不少于2次，并保证待测体系的体积不低于5 mL、PC 12总数不低于3×106个。

依据本文作者近来报道的类羟化酶电化学传感法[13]，执行本研究中的催化材料合成、电化学传感法检测、性能评估和标准曲线制备等实验步骤。该方法对DA的检出范围在0.05～16.7μM之间，电流（I）与多巴胺浓度（c）的线性方程为I（μA)=0.592 c（μM)+0.145(R2=0.998），检出限为37 nM。利用电化学工作站（CHI 730 E，北京辰华科技有限公司）开展本研究中的电化学测试。先构建一个三电极系统（其中修饰电极作为工作电极，铂片电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极），并将其插入5 mL细胞体系中。实验采用计时电流法实时记录电流响应。待电流稳定后，向体系中快速加入50 mM KCl溶液，并持续记录电流响应的变化。最后，基于多巴胺浓度与电流值绘制的标准曲线，换算出PC 12的DA释放量。

1.4细胞裂解液中氧化应激指标的测定

将20μg/mL的PET分别加入盛放PC 12的6孔培养板中，记作暴露组。同时设置未加入PET的PC 12培养板为空白对照组。经过24 h处理后，离心弃去培养基，用无菌生理盐水至少冲洗3次。随后每孔加入500μL的0.1%Triyon X-100裂解细胞，再转移至2 mL离心管中，以转速8000 r/min离心7 min，取上清液，获得细胞裂解液。采用南京建成生物工程研究所制备的试剂盒，分别测定细胞裂解液中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）与丙二醛（malondialdehyde,MDA），具体实验步骤参照相应的试剂盒说明书。

1.5数据分析

采用SPSS 29.0软件（T检验）（美国IBM公司），对本研究各模拟实验中组间数据的差异性进行统计分析。p<0.05表示差异显著，具有统计学意义。采用Origin 2021（美国OriginLab公司），完成本文中所有的图形绘制。

2、结果与讨论

2.1 PET的理化性质

利用SEM，研究不同光老化时间（0、6 h、12 h、24 h、48 h）对100 nm PET表面形貌的影响。如图1所示，PET-0纳米颗粒呈规则球形，粒径分布均匀，排列有序，表面光滑，呈现出良好的单分散性。而经光老化后，PET纳米颗粒的形状和粒径均发生了不规则变化，颗粒表面粗糙程度增加，且团聚现象明显。如图1 A所示，随着光老化时间的延长，PET纳米颗粒之间的团聚面积逐渐增大。此外，初始PET呈白色悬浊液，而经光老化和机械磨损后，微塑料溶液中产生了大量漂浮的微小白色颗粒碎屑，这与先前的文献报道相符[16]。以上结果表明，光老化过程在分子层面上影响了PET纳米颗粒的表面性质和微观结构[17]。

为了探究光老化时间对PET理化性质的影响，本研究利用纳米粒度及Zeta电位分析仪，对经历不同时间光老化的PET进行了流体动力学直径和表面电荷的测定与分析。如图2所示，经0、6 h、12 h、24 h、48 h老化处理，100 nm PET在细胞培养基中的水合粒径分别为（134.8±3.5) nm、（132.3±1.1) nm、（132.0±3.1) nm、（132.1±0.4) nm、（129.5±3.2) nm。Zeta电位分别为（-25.3±0.9) mV、（-36.6±0.8) mV、（-37.0±0.4) mV、（-39.3±0.8) mV、（-40.5±1.9) mV。结果表明，光老化过程并未对PET的水合粒径产生影响，但导致PET的表面电荷发生明显变化。PET呈现出负的Zeta电位值，且随着老化时间的延长，PET携带的负电荷亦逐渐增加，这是由于其对污染物的吸附能力与表面所携带的电荷能量密切相关[18]。Fan等[19]的研究也验证了这一结论，即表面电荷改变是影响PET对环境中污染物的吸附速度与吸附能力的重要原因。可见，自然环境中的老化效应会改变微塑料的理化性质，从而使其环境风险的不确定性增大。

图1 不同老化时间PET的SEM图像

A和B的放大倍数分别为2万倍和10万倍，比例尺分别为400nm和100 nm

光老化PET表面易发生氧化反应，导致其原有特征峰的强度变化或峰位发生微小偏移，甚至改变了原有的化学结构。本研究利用FTIR，在不同光老化时间（0、6 h、12 h、24 h、48 h）下，对PET-NPs表面的化学结构变化情况进行了分析。如图3所示，PET呈现出6个特征吸收峰，这些吸收峰分别位于700 cm-1、1112 cm-1、1450 cm-1、1490 cm-1、1600 cm-1、2920 cm-1处，这6处吸收峰分别与酯键中的C-O键、酮基、C-H键、C-H键、C=C键、-COO-基团和-CH2-键的变形、拉伸和弯曲有关[20-21]。值得关注的是，在红外光谱中未观察到光老化PET有新的特征峰出现，这可能是光解反应主要发生在PET的表面，且受到PET厚度的限制所致[22]。据文献所述，羰基指数（carbonyl index,CI）可作为评估微塑料老化程度的关键指标。通过计算羰基（1600 cm-1）和亚甲基（1450 cm-1）的吸收强度比值，可定量并直观揭示MPs在光老化过程中的性质变化[20]。由图3可知，尽管老化PET的羰基吸收带强度相对较低，但其羰基指数却高于PET-0，并且随着老化时间的延长，CI值亦不断增加，这与Ding等[20]的报道相符。

图2 不同光老化时间（pH=7.0）处理的PET流体动力学半径和表面电荷变化

图3 不同光老化时间处理的PET的傅里叶变换红外光谱

2.2老化PET及协同作用对细胞活力的影响

当纳米塑料所诱发的细胞毒性超过阈值，即会引起细胞萎缩、凋亡等不良反应，甚至干扰神经毒性的单一评估。因此，需要确定PET产生细胞毒性效应的最大无作用剂量。本研究通过CCK-8法，探究了浓度范围为0.1～500μg/mL的100 nm光老化PET-NPs对PC12的细胞活力的影响，以确定PET的最大无作用剂量。如图4所示，细胞活力随着PET暴露浓度增加大致呈下降趋势，这与Rubio等[23]的报道一致。CCK-8的测试结果说明PET的最大无作用剂量会受其老化程度影响。由图4可见，PET经过0、6 h、12 h、24 h、48 h光老化的最大无作用剂量分别为50μg/mL、50μg/mL、50μg/mL、20μg/mL、20μg/mL。上述结果表明随着老化程度的加剧，纳米塑料的表面粗糙度增加，分散度加深，表面性质发生明显变化，从而抑制了细胞活力，增强了对神经细胞的毒性效应。

图4 不同光老化PET暴露浓度下的细胞活力变化

当PET暴露浓度为20μg/mL时，与对照组相比，PC 12存活率均不存在显著性差异（p>0.05）。因此，本研究选用该暴露浓度作为最大无作用剂量来开展后续实验，以保证研究的有效性。

2,4-二氨基丁酸（2,4-Diaminobutyric acid,DAB）是神经毒素β-N-甲氨基-L-丙氨酸（β-N-methylamino-L-alanine,BMAA）最常见的同分异构体之一，在全球海洋环境中广泛存在，主要来源于海洋蓝藻门。DAB在动物肝脏中积聚会导致体内的氨浓度升高，进而诱导迟发性神经毒性的发生[24]。为了探究DAB与海洋塑料共存对PC 12的复合毒性效应，本研究考察了在20μg/mL PET-48 h存在的条件下，细胞暴露于不同浓度（0.1～500μM)DAB中的活力变化。如图5所示，细胞活力随着DAB的暴露浓度增加呈下降趋势。当暴露浓度为50μM时，与对照组相比，PET+DAB暴露组的细胞存活率不存在显著性差异（p>0.05）。由此可知，在20μg/mL PET-48 h存在的条件下，DAB对PC 12的最大无作用剂量为50μM。

图5 20μg/mL PET-48 h组在不同DAB暴露浓度下的细胞活力

2.3老化PET与DAB对PC 12的复合神经毒性效应

为深入探究老化PET纳米塑料与DAB的复合神经毒性效应，本研究测定了PC 12在老化PET单一暴露及其与DAB共暴露下的DA释放量。如图6所示，随着老化时间延长，DA的释放量逐渐降低。当PC 12分别暴露于光老化0、6 h、12 h、24 h、48 h的PET时，DA的释放量依次为1.73μM、1.69μM、1.57μM、1.33μM、1.02μM，与对照组（PET-0）均存在显著性差异（p<0.05）。当老化时间为24 h时，DA的释放量差异极其显著（p<0.01）。PET-48 h单一暴露组与PET-48h+DAB共暴露组的DA释放量亦表现出显著差异（p<0.05）。该研究结果表明，老化时间延长会导致PET毒性增加。这种现象不仅是NPs自身的理化性改变所致，还与吸附污染物的协同作用有关。具体而言，NPs在海洋环境中的老化过程以及与其他污染物间的协同作用，会影响DA的神经传递和相关基因表达，导致神经系统的功能障碍，甚至严重危害生物的行为意识[25]。基于上述结论，以DA释放量作为评估不同老化时间PET潜在神经毒性风险的指标，风险大小为PET-48 h>PET-24 h>PET-12 h>PET-6 h>PET-0。此外，还有研究发现，随着PET老化时间的延长，纳米塑料会发生明显的脆化和裂解现象，使得有机添加剂从中浸出的程度加剧，进而增强了细胞的毒性作用，破坏神经传递和发育等功能，引发潜在的神经毒性[26]。

图6 光老化PET及其与DAB共暴露对DA释放量的影响（A）和电流响应的变化（B)

2.4老化PET诱导的潜在神经毒性机理

众所周知，随着光老化程度的加剧，微塑料诱导细胞产生活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）的能力随之增加，ROS强氧化直接作用于细胞膜，从而对细胞活力产生明显抑制作用。此外，细胞还会通过分泌抗氧化酶降低氧化应激作用产生的ROS。氧化应激作用的强度可通过检测指标来评价，研究中常用的氧化应激评价指标有MDA、SOD和GSH-PX。MDA含量常被用作评估脂质过氧化的程度[27]。而SOD和GSH-PX作为细胞内关键的自由基防御工具，对于维持细胞稳态具有至关重要的作用[28]。为了探究老化PET对PC 12的潜在毒性机理，本研究进一步探究了在不同时间老化的PET纳米塑料作用下，PC 12胞内SOD、GSH-PX和MDA等抗氧化酶及脂质过氧化指标的活性变化。与对照组相比，当细胞暴露于老化PET时，SOD浓度明显增加了6.73～8.24倍（图7 A),GSH-PX浓度却下降了4.55～5.26倍（图7 B）。该结果表明，PET可导致细胞抗氧化酶的失调，进而破坏细胞中ROS的平衡，造成毒性效应。如图7 C所示，20μg/mL的PET-24 h与PET-48 h诱导MDA含量分别提高了2.03倍和5.12倍（p<0.01），这不仅验证了老化程度对PET毒性的显著影响，更重要的是该结论直接表明了光老化PET对PC12脂质过氧化反应具有明显的诱导作用。进一步分析显示，老化时间对SOD、GSH-PX和MDA的活性产生了明显影响。尽管在老化PET中的暴露普遍提升了细胞中的SOD活性，但在老化时间为0、6 h、12 h、24 h的PET暴露组间，SOD的活性变化差异不具有统计学意义（p>0.05）。此外，当PC 12暴露于光老化PET时，其SOD和MDA的含量均显著增加（p<0.05），这与Wang等[29]的研究结论相符，光老化微塑料同样显著提升了小球藻内MDA的浓度，并增强了SOD活性，使小球藻足以抵御紫外线暴露所产生的过量ROS。可见，在低剂量PET暴露条件下，细胞内抗氧化酶的适应性提升是应对活性氧自由基失衡的重要机制；而在较高剂量PET暴露条件下，由于细胞损伤导致的抗氧化酶活性降低是胞内ROS增加蓄积的重要因素，因此会造成严重的毒性作用。氧化应激作为神经毒性的关键要素，已被广泛认为与神经系统疾病中的细胞死亡现象密切相关[30]。老化PET诱导的氧化应激可能直接损害神经元细胞，从而引发神经毒性。

图7 PC 12暴露于不同光老化时间PET中氧化应激评价指标的变化

3、结论

(1）光老化过程会改变微塑料的理化性质。表征分析表明，光老化PET的表面粗糙程度增加，形状和粒径发生不规则变化，出现大面积的团聚现象。随着老化程度的增加，PET所携带的负电荷也随之增多。老化PET的羰基指数高于未老化PET，且随着老化时间的延长，羰基指数持续增加。

(2）在初始PET处理下，PC 12的DA释放量降低，随着老化程度的提升，PET对DA释放的抑制作用愈加明显。相较于老化PET单一暴露，老化PET与海洋毒素DAB共暴露对海洋生物构成的威胁更大。

(3）神经细胞暴露于老化PET中诱导氧化应激反应，破坏胞内ROS稳态，产生毒性效应，进而导致SOD和MDA含量增加，GSH-PX活性降低，抗氧化酶失调进一步导致ROS积累，继而可能诱发海洋生物的神经毒性。

参考文献:

[11]肖杰锋.邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)通过损害多巴胺能信号传导改变斑马鱼运动行为功能及其机制[D].汕头:汕头大学,2021.

[24]李爱峰,闫业举,邱江兵,等.神经毒素BMAA的生物合成､食物链传递及其致病机理的研究进展与展望[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2023,53(2):10-21.

基金资助:国家自然科学基金项目(21976022);

文章来源:陈博,邢逸飞,赵慧敏.光老化PET纳米塑料对海洋生物的神经毒性风险[J].海洋环境科学,2024,43(06):954-962.