黑水虻(HermtiaillucensL.),学名亮斑扁角水虻,属双翅目水虻科扁角水虻属,分布广泛｡黑水虻幼虫可高密度聚集于畜禽粪便､餐厨垃圾等有机废弃物中取食活动,生长速度快,抗逆性强,易于饲养;成虫产卵量大,无需补充营养,不飞入人类住宅和动物圈舍,不会传播病虫害;虫体蛋白含量高,可作为饲料蛋白添加剂[1]｡黑水虻已被作为理想的生物反应器,用于资源化处理有机废弃物｡但在黑水虻生物转化过程中,作为饵料的厨余垃圾和畜禽粪污因为堆积､分解而产生的大量恶臭气体问题仍然严重[2]｡恶臭气体的排放,造成了有机废弃物的营养流失,污染空气,危害人类与动物健康[3]｡其中,恶臭气体硫化氢(H2S)因为高臭气指数(1.7×107)和低嗅阈值(0.0007mg·m-3)而受到广泛关注[4]｡硫化氢对呼吸道和眼睛的刺激较大,浓度达1mg·L-1或更高时,会对周边生物的健康造成危害[4]｡因此,减少乃至消除硫化氢排放是黑水虻养殖需要解决的关键问题之一｡

微生物可吸附､吸收液相中的恶臭气体分子,并在细胞生长代谢过程中将之作为营养物质分解利用,从而去除恶臭气体分子[5]｡用微生物脱硫法消除硫化氢具有成本低､无二次污染､使用方便､可带来二次收益等优点,逐渐成为养殖场治理恶臭气体的主要方法[4]｡叶芬霞等[6]从猪场土壤分离筛选出3个菌株(分别属巨大芽孢杆菌､灰色链霉菌和热带假丝酵母),将之作为脱硫菌复合剂处理猪粪,对硫化氢脱除率可达65%｡赵晨曦等[7]从鲜鸡粪筛选得到5株嗜粪微生物菌株,复合发酵鸡粪可降低硫化氢54.44%｡于淑豪等[4]从奶牛场污水获得的1株盐单胞菌,对污水中的硫化氢脱除率达47.1%｡除臭微生物在除臭环境中定殖,成为土著菌群的一部分,甚至成为优势菌群,是微生物高效除臭的关键[5]｡目前,用于去除硫化氢的脱硫菌主要从畜禽养殖场及污水污泥中分离获得,对黑水虻虫砂(虫粪)中的脱硫菌研究鲜见报道｡本试验通过富集法,分离､鉴定黑水虻虫砂的脱硫菌种类,并测定其脱硫活性,为研制硫化氢脱硫菌剂提供参考｡

1、材料与方法

1.1供试材料

1.1.1黑水虻虫

在方形塑料盒(520mm×350mm×150mm)中放入含水量70%的麦麸;将同日产的黑水虻卵置于尼龙纱网里,放在麦麸上;再将方形盒连同黑水虻卵放入人工气候箱(温度27±1℃,湿度70±7%)｡黑水虻幼虫从卵孵化出来后进入麦麸取食生长,待到幼虫长至老熟幼虫后,采集虫砂用于脱硫细菌的富集､分离｡

1.1.2脱硫菌富集培养基

蛋白胨10g､牛肉膏2g､NaCl5g､Na2S·9H2O2g,pH6.5~7.5,加蒸馏水调至1L,分装至500mL三角瓶,121℃灭菌20min,备用｡

1.1.3脱硫菌分离平板

按17g·L-1浓度在脱硫菌富集培养基中加入琼脂,121℃灭菌20min,冷却至50℃倒平板备用｡

1.1.4其他主要试剂

Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司);PCR扩增试剂(上海生工生物工程服务有限公司);16SrDNA扩增引物(正向引物:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',反向引物:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3',上海生物工程有限公司)｡

1.2试验方法

1.2.1脱硫菌的分离纯化

1.2.1.1脱硫菌的富集

参考徐庆贤等方法[8],取10g虫粪加入250mL三角瓶中,加入90mL无菌水及5粒玻璃珠(直径2mm),震荡30min制成菌悬液｡移取10mL菌悬液至100mL脱硫菌富集培养基中,30℃,120r·min-1培养6d后,移取10mL培养液到新鲜的100mL脱硫菌富集培养基中继续培养,如此每隔6d转移至新的富集培养基中,直至连续培养30d,获得富集培养液｡

1.2.1.2脱硫菌分离纯化

在18mm×180mm试管中装入9mL蒸馏水,灭菌,冷却｡用无菌水将获得的脱硫菌富集培养液稀释至10-2､10-3､10-4､10-5､10-6浓度,并取适合的浓度,涂布于固体脱硫选择性培养基上,30℃倒置培养2~3d,观察菌的生长情况,将要纯化的菌落标记,挑取少许将要纯化的菌落至相应标记的平板上进行连续划线纯化,划线后放在30℃温箱中培养1~2d,并以-80℃甘油冷冻保存方式进行保存,每株菌保存3管｡

1.2.2菌株16SRNA序列分析

参考徐庆贤等方法[8],将分离､纯化的菌株划线培养于脱硫菌分离平板上,30℃培养2d｡将培养物刮入无菌水中,制成细菌悬浮液,提取DNA模板｡采用细菌16S通用引物27F和1492R进行PCR扩增｡PCR反应总体积为25μL｡反应体系为10×PCRBuffer2.5μL,Taq酶0.25μL,10mMdNTP0.5μL,27F(10pmol)1.0μL,1492R(10pmol)1.0μL,Temple1μL,采用无菌水定容至25μL｡反应程序为94℃预变性5min,循环的程序为94℃变性30s,55℃退火60s,72℃延伸90s,共29个循环,最后72℃延伸10min,扩增结束后,取5μLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳以检查扩增结果｡将合格的16SRNA扩增产物送往上海博尚生物科技有限公司测序｡

1.2.3菌株脱硫性能测定

1.2.3.1供试菌液制备

将LB液体培养基灭菌后冷却至50℃,加入经细菌过虑器过虑后的Na2S溶液,并使得Na2S在培养基中的最终含量为2mg·mL-1｡将此培养基分装至三角瓶,分别接入复筛获得的硫化氢降解菌菌株,在30℃条件下摇瓶培养2d｡用血球计数板将各株培养液的降解菌浓度调节至约1×107cfu·mL-1,备用｡

1.2.3.2菌株的硫(S2-)氧化活性测定

取1×107cfu·mL-1待测菌液5mL,接种至100mL脱硫菌富集培养基中,另取5mL无菌水加入脱硫菌富集培养基作为对照,30℃､180r·min-1摇床培养｡依据《水质硫化物的测定亚甲基蓝分光光度法》(HJ1226-2021),在开始摇床培养后0h､24h､48h､72h､96h取样,在绥净多参数水质检测仪(河南绥净环保科技有限公司,型号GNST-900S)采用检测配套的试剂盒测定样品中硫化物含量,将接菌处理组与空白对照组的硫化物含量进行对比,计算硫化物去除率,公式:

1.2.3.3菌株对鸡粪H2S的减排效果测定

将50g新鲜鸡粪加入到5000mL白色塑料桶(上口直径204mm,底面直径183mm,高205mm),按10%比例接入菌液5mL｡另以5mL无菌水代替菌液作为对照组｡每株菌及对照设3个重复试验｡将桶口用双层塑料膜密封,在桶侧壁靠上部位刺一小孔(直径约3mm,在各桶侧壁上的位置尽量一致),再以标签纸封住小孔｡将各处理好的桶置于30℃培养箱遮光处理,6d后用手持式硫化氢检测仪检测各桶的硫化氢浓度｡测定时,将测定仪的进气口套以200μL移液枪枪头,刺穿标签纸通过小孔,测定各桶处理长生的硫化氢浓度｡以对照组为参照,计算各菌株对硫化氢的去除率,公式:

1.2.4数据分析

将获得的序列通过网站GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对分析,选择相关的参考菌株序列,利用ClustalX对齐,在Mega5.0上聚类分析,采用邻接连接法(Neighbor-Joining)和Jukes-Cantor进化距离构建聚类树,Bootstrap法检验(次数为1000次)[8]｡在DPS数据处理系统中,采用Tukey多重比较方差分析方法进行不同菌株脱硫活性的比较[9]｡

2、结果与分析

2.1菌株分离结果分析

按菌落特征,从脱硫菌富集培养液分离､纯化了5株菌株,分别为FJAT-48036､FJAT-48037､FJAT48038､FJAT-48039和FJAT-48040｡脱硫菌富集培养液中,与FJAT-48040相似菌落的菌浓度估值1×107cfu·mL-1,而与FJAT-48037相似的菌落数较少,在富集培养液中的浓度估值为2×105cfu·mL-1,见表1｡用特异性引物27F和1492R为引物PCR检测所提取的DNA｡所有菌株均扩增出1400~1500bp左右的条带,与预计的目的片段大小相同,并且条带明亮,无拖尾现象｡测序结果显示,序列长度约1400bp｡在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中比对5株菌株的16SRNA基因测序,结果如表1所示,FJAT-48036和FJAT-48038属于产碱杆菌属(Alcaligenes),FJAT-48037属肠球菌属(Enterococcus),FJAT-48039为亮杆菌属(Leucobacter),FJAT-48040为假苍白杆菌(Pseudochrobactrum)｡

基于16SrDNA序列的系统发育树分析表明,见图1,菌株FJAT-48036､FJAT-48038与AlcaligenesfaecalisstrainNBRC1311(NR_113606)处于系统发育树中的同一最小分枝(Bootstrap值为66%),紧邻的上一节点分枝包括A.aquatilisstrainLMG22996(NR_104977)和A.ammonioxydansstrainHO-1(MN636701),说明菌株FJAT-48036､FJAT-48038同属于产碱杆菌属(Alcaligenes),并且与A.faecalis亲缘最近｡菌株FJAT-48040与PseudochrobactrumasaccharolyticumstrainCCUG46016(NR_042519)亲缘最近,两者处于系统发育树同一最小分枝,再与同属的另一种P.kiredjianiae组成次小分枝｡FJAT-48039与Leucobacterchromiireducenssubsp.solipictus的16SrDNA序列最相似,FJAT-48037则与Enterococcusgilvus最相似｡

图1分离菌株基于16SrDNA序列构建的分子系统发育树

表1富集分离的5株脱硫菌及其16SrDNA序列比对结果

2.2菌株脱硫活性测定

2.2.1菌株的硫(S2-)氧化活性

各菌株在不同处理时间内对培养基中的S2-去除率如图2所示｡接菌发酵24h时,菌株FJAT-48038对S2-的去除率显著高于菌株FJAT-48036(p<0.05)｡随着处理时间的延长,各菌株对S2-的去除率均升高,但菌株FJAT-48038､FJAT-48039和FJAT-48040对S2-的去除率呈高于菌株FJAT-48036和FJAT-48037的趋势｡到接菌发酵96h时,菌株FJAT-48038､FJAT-48039和FJAT-48040对S2-的去除率为69.96%~73.50%,显著高于FJAT-48036和FJAT-48037对S2-的去除率48.41%~49.82%(p<0.05)｡

2.2.2菌株对鸡粪H2S的减排效果

在5000mL容器中放入50g新鲜鸡粪,接入5mL各菌株菌液,密闭发酵6d后测定H2S浓度｡结果如图3所示,与未接菌处理的对照组相比,各菌株对H2S均有去除效果,去除率44.66%~71.01%｡其中菌株FJAT-48038､FJAT-48039和FJAT-48040对H2S的去除率显著高于FJAT-48036和FJAT-48037(p<0.05)｡菌株FJAT-48040对H2S的去除率最高,但与FJAT-48038无显著差异,与其余4株菌株差异显著(p<0.05)｡

图3不同菌株对鸡粪释放硫化氢(H2S)的去除率

3、讨论与结论

随着脱硫菌分离､筛选工作的开展,报道的脱硫菌种类越来越多,已涉及粪产碱杆菌属､硫杆菌属､芽孢杆菌属､假单胞菌属､黄单胞菌属､短杆菌属､红球菌属等10多个细菌种属[10]｡不同生物样品,分离到的脱硫菌种类不同｡周东兴等[11]采用脱硫菌选择性培养基,从蚯蚓粪中富集､分离得到具有脱硫功能的菌为芽孢杆菌､黄单胞杆菌和假单胞杆菌｡刘雪纯从猪场采集的样品中分离到脱硫菌为地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌｡李玥等[12]则从鸡粪堆肥中分离脱硫功能菌为芽孢杆菌､耐寒短杆菌､木糖葡萄球菌和变异棒杆菌｡本试验从麦麸饲养的黑水虻虫砂样品中分离的脱硫菌分别属于产碱杆菌属(Alcaligenes)､肠球菌属(Enterococcus)､亮杆菌属(Leucobacter)和假苍白杆菌(Pseudochrobactrum)｡这与上述报道的细菌组成不同｡其中,粪产碱杆菌的脱硫功能多有报道,如从浓缩乳胶废水[13],固定膜生物洗涤塔[14],新鲜鸡粪[10]中均分离到具有脱硫功能的粪产碱杆菌菌株｡肠球菌有产酸功能,具有益生作用｡孟竹等从猎鹰粪便中分离3株肠球菌具有良好的益生性[15]｡蒙琦等将粪肠球菌与酵母菌､枯草芽孢杆菌､乳酸片球菌､双歧杆菌混合后喂养鸡可显著降低氨气和硫化氢的排放[16]｡关于亮杆菌和假苍白菌的脱硫功能研究鲜见报道｡

脱硫菌存在多种硫氧化酶和氧化途径,能将HS-/S2-氧化产生单质硫或SO42-[10]｡通过检测培养基中硫化物S2-的浓度变化或接菌处理后的H2S释放量,可以计算脱硫菌的脱硫性能｡以Na2S为基础营养,刘雪纯等[17]测定了从猪场粪污分离到的14株脱硫菌对S2-脱除率为38.16%~86.12%;徐庆贤等[8]测定了从鲜鸡粪中分离到的5株脱硫菌对S2-脱除率为34%~78%｡本研究分离的5株脱硫菌对培养基中S2-脱除率为48.41%~71.01%｡所以不同菌株对培养基中S2-脱除率有所不同｡周东兴等[11]用蚯蚓粪分离到的6株脱硫菌分别处理鲜鸡粪25d,与CK相比H2S释放量降低16.41%~53.48%;将不同菌株复配可使得H2S释放量降低71.53%｡李敏等[10]从新鲜鸡粪分离到产碱杆菌,在最佳条件(35℃,2d)下处理鸡粪可使H2S释放量降低95%｡本研究中,FJAT-48036和FJAT48037处理鲜鸡粪6d,与CK相比,H2S释放量分别降低49.33%和44.66%,而用菌株FJAT-48038､FJAT-48039和FJAT-48040处理时,H2S释放量降低59.33%~71.01%,低于李敏等的研究结果,这可能与处理温度有关｡各菌株间的复配,以及温度､pH等脱硫处理条件都能影响H2S释放量,本研究分离到的脱硫菌株,其影响脱硫活力的条件有待进一步研究｡

参考文献:

[1]陈杰,邝哲师,肖明,等.畜禽粪便处理的优质昆虫黑水虻[J].安徽农业科学,2014,42(24):8180-8182.

[2]马聪.黑水虻生物转化过程典型污染气体释放规律分析[J].当代化工研究,2023(15):71-73.

[4]于淑豪,翟中葳,沈丰菊,等.硫氧化菌筛选及生物氧化特征研究[J].农业环境科学学报,2022,41(10):2287-2297.

[5]刘建伟,段粹,刘越.微生物菌剂处理畜禽养殖场含氨和硫化氢气体技术进展[J].黑龙江畜牧兽医,2018(11):72-75.

[6]叶芬霞,朱瑞芬,叶央芳.复合微生物吸附除臭剂的制备及其除臭应用[J].农业工程学报,2008(08):254-257.

[7]赵晨曦,兰时乐,禹逸君,等.鸡粪除臭微生物菌群的筛选和应用[J].湖南农业科学,2005(01):68-70.

[8]徐庆贤,刘芸,阮传清,等.养鸡发酵床垫料中脱硫菌的分离及鉴定[J].农业与技术,2023,43(20):119-121.

[9]唐启义.DPS数据处理系统[M].北京:科学出版社,2016.

[10]李敏,王琦,魏菁,等.粪产碱杆菌的分离鉴定及其生物转化作用[J].微生物学通报,2021,48(10):3612-3620.

[11]周东兴,徐明明,迟婷婷,等.蚯蚓粪中异养脱硫菌筛选及效果测定[J].东北农业大学学报,2015,46(09):59-63.

[12]李玥,李成成,李静,等.鸡粪除臭菌的分离筛选及除臭效果分析[J].农业环境科学学报,2020,39(05):11031110.

[15]孟竹,何江,李静,等.阿合奇县猎鹰粪源海氏肠球菌的分离鉴定及其生物学特性分析[J].中国畜牧兽医,2024,51(10):4587-4595.

[16]蒙琦,刘瑞生,徐建峰,等.复合微生物添加剂对肉鸡圈舍有害气体浓度的影响[J].饲料研究,2021,44(21):4751.

[17]刘雪纯,耿晓晴,丁轲,等.规模化猪场粪污高效脱硫菌的分离､筛选与鉴定[J].中国畜牧杂志,2020,56(03):107-110.

基金资助:福建省科技厅农业引导性项目(项目编号:2021N0026);福建省科技厅公益类科研项目(项目编号:2022R1032003);

文章来源:阮传清,刘芸,徐庆贤,等.黑水虻虫砂脱硫菌的分离与活性测定[J].农业与技术,2025,45(03):44-48.