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成纤维细胞生长因子2在椎间盘退行性变中的作用及机制

2023-12-28 47 上传者：管理员

摘要：目的探讨成纤维细胞生长因子2(FGF2)在椎间盘退行性变（IDD）中的作用及调控机制。方法收集青年（6月龄）小鼠正常椎间盘及老年（24月龄）小鼠发生退行性变的椎间盘组织，通过免疫组织化学染色和蛋白质印迹法检测FGF2在IDD中的表达变化。培养原代大鼠髓核细胞，采用促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)诱导退行性变，并予以FGF2重组蛋白、FGF2中和抗体、FGF2干扰RNA等处理，通过流式细胞术、实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测髓核细胞凋亡、细胞外基质（ECM）代谢相关基因表达及Wnt/β-catenin信号通路活性改变；采用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂（PRI-724）处理FGF2重组蛋白刺激后的髓核细胞，明确Wnt/β-catenin信号通路对FGF2调控IDD的影响。结果 FGF2表达水平在老年小鼠椎间盘组织及髓核细胞内均高于青年小鼠（P <0.05）;FGF2重组蛋白促进正常髓核细胞凋亡及ECM分解相关基因表达，而FGF2中和抗体及干扰RNA在发生退行性变的细胞中作用相反。Wnt/β-catenin信号通路在FGF2重组蛋白或IL-1β刺激的髓核细胞内显著激活，PRI-724抑制该通路活性，可削弱FGF2对髓核细胞凋亡及ECM代谢的调控作用。结论发生IDD时，髓核细胞FGF2表达升高，通过Wnt/β-catenin信号通路促进髓核细胞凋亡及ECM降解，进一步加速IDD进程。

关键词：
成纤维细胞生长因子2
椎间盘退行性变
纤维环破裂
细胞凋亡
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椎间盘是相邻椎体之间的软骨组织，由中央髓核、外围纤维环及上下两端软骨终板构成，在维持脊柱稳定性、缓冲生物应力中发挥重要作用，当椎间盘发生退行性变时，其内在弹性丧失，易在急性应力作用下发生纤维环破裂、髓核突出、椎间高度丢失，导致颈腰痛等临床症状[1]。目前，临床针对椎间盘退行性变（IDD）相关疾病（如颈椎病、腰椎椎间盘突出、椎管狭窄等）的治疗主要包括非手术治疗（功能锻炼、热疗、物理治疗，口服解热镇痛药、局部神经阻滞等）和手术治疗（椎间盘切除融合术、人工椎间盘置换术、椎板切除植骨融合术、椎管扩大椎板成形术等），部分患者症状可获得有效缓解，但易复发[2,3]，究其原因是IDD发生机制尚不明确，现有治疗手段均不能从发生机制着手，无法延缓甚至逆转退行性变进程。

IDD主要表现为髓核细胞凋亡、细胞外基质（ECM）代谢紊乱（合成减少、分解增加）、炎性反应、神经和血管长入椎间盘等病理过程，其中以ECM代谢紊乱最为重要[4]。椎间盘ECM主要包含蛋白聚糖（主要是糖胺聚糖）和Ⅱ型胶原，椎间盘发生退行性变时，糖胺聚糖和Ⅱ型胶原表达显著减少，导致椎间盘ECM减少、含水量丢失[5]。多项研究[6,7]表明，Wnt/β-catenin信号通路可诱导髓核细胞凋亡及ECM降解，进而加速IDD进程。成纤维细胞生长因子2(FGF2）对ECM代谢具有重要影响，Meo Burt等[8]在FGF2过表达的小鼠软骨组织中发现Wnt/β-catenin信号通路显著激活，说明FGF2对该通路具有调控作用，而这种调控作用是否同样存在于椎间盘组织尚未可知。因此，本研究拟探索FGF2在IDD中的功能及对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响，旨在为阐明IDD关键致病因子及调控机制提供理论依据。

1、材料与方法

1.1试剂和仪器

FGF2抗体（ab92337）、ACAN抗体（ab3778）、MMP3抗体（ab52915）、ADAMTS-4抗体（ab185722）均购自Abcam公司，activeβ-catenin抗体（05-665）购自Millipore公司，phospho-β-catenin抗体（2009）、β-catenin抗体（8480）购自Cell Signaling Technology公司，cleaved-caspase3(ab32042）、BAX(ab32503）、Bcl2(182858）购自Abcam公司；促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β）购自Peprotech公司，FGF2重组蛋白（3718-FB）购自R&D公司，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂PRI-724购自Selleck公司；TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（RR820A）及反转录试剂盒（RR047A）购自TaKaRa公司。GeneAmp9700型荧光定量PCR仪为Applied Biosystems公司产品。ELISA检测试剂盒（ERA4RB）购自Thermo Fisher公司，干扰RNA均购自吉玛基因。

1.2小鼠组织标本获取及处理

6月龄和24月龄小鼠各10只，购自海军军医大学实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0002]。将6月龄小鼠椎间盘设定为正常椎间盘，将24月龄小鼠椎间盘设定为老年退行性变椎间盘。采用CO2吸入法处死小鼠，而后沿背部正中线剪开皮肤及皮下软组织，分离肌肉后离断腰椎部分，剔除腰椎周边肌肉，取出椎间盘组织。部分标本置于4%多聚甲醛中固定24～36 h，按常规方法脱钙、石蜡包埋、切片，进行HE染色、Masson染色和番红固绿染色，评估IDD情况。对切片进行免疫组织化学染色，观察FGF2的表达情况。剩余标本冻于液氮中，用于蛋白质印迹法检测FGF2表达水平。

1.3髓核细胞培养及处理

根据Risbud等[9]的方法提取髓核细胞，从140～160 g Sprague-Dawley大鼠[20只，购自海军军医大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0002）]髓核组织中分离原代髓核细胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基制备细胞悬液后置于37℃、5%CO2细胞培养箱中静置72 h，观察细胞贴壁情况并更换细胞培养基，之后每3 d更换一次培养基，待细胞生长至约80%汇合时进行传代或冻存，取2～4代的髓核细胞进行实验。①收集大鼠髓核细胞，分别采用0、10、25、50 ng/mL促炎因子IL-1β刺激诱导细胞退行性变，通过蛋白质印迹法和ELISA分别检测FGF2在细胞内表达及分泌至细胞外的含量。②采用0、5、10、50 ng/mL FGF2重组蛋白刺激正常髓核细胞，采用0、0.5、1.0、5.0μg/mL FGF2中和抗体干预经25 ng/mL IL-1β预处理的退行性变髓核细胞，采用FGF2干扰RNA(siFGF2,25 pmol）和阴性对照（siNC,25 pmol）转染经25 ng/mL IL-1β预处理的退行性变髓核细胞，通过流式细胞术及TUNEL染色检测髓核细胞凋亡情况，通过蛋白质印迹法检测髓核细胞内凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（activeβ-catenin、β-catenin、磷酸化β-catenin）的表达水平，通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ECM代谢相关基因（ACAN、COL2A1、MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）的表达水平。③采用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂（PRI-724）处理FGF2重组蛋白刺激后的大鼠髓核细胞，通过流式细胞术和TUNEL检测髓核细胞凋亡情况，通过蛋白质印迹法检测髓核细胞内凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）表达水平，通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ECM代谢相关基因（ACAN、COL2A1、MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）的表达水平。

1.4统计学处理

采用Graphpad 9.0软件对数据进行统计分析。各组数据采用D’Agostino-Pearson omnibus normality和Shapiro-Wilk normality检验进行正态性分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用Student t检验，多组间比较采用单因素方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 FGF2在椎间盘退行性变时表达水平上调

小鼠椎间盘组织病理学染色结果显示，相较于6月龄小鼠，24月龄小鼠椎间盘内类圆形髓核细胞数目显著减少，分布散在稀疏，ECM中胶原纤维排列紊乱，蛋白聚糖含量显著降低，符合IDD组织学变化（图1a）。免疫组织化学检测结果显示，发生退行性变的椎间盘内FGF2阳性的髓核细胞比例显著高于正常椎间盘（P<0.05，图1b、c）；蛋白质印迹法检测结果显示，发生退行性变的椎间盘内FGF2蛋白含量显著高于正常椎间盘（P<0.05，图1d）。以上结果从组织学层面说明FGF2在IDD时表达增加。

为进一步验证IDD对FGF2表达的影响，收集大鼠髓核细胞，采用不同浓度促炎因子IL-1β刺激诱导细胞发生退行性变，通过蛋白质印迹法和ELISA分别检测FGF2在细胞内表达及分泌至细胞外的含量，结果显示，FGF2在促炎因子IL-1β诱导发生退行性变的髓核细胞内表达及分泌水平显著上调，其峰值出现在IL-1β浓度为25 ng/mL时（图1e、f）。因此，将25 ng/mL定为IL-1β最适作用浓度用于后续实验。

2.2 FGF2促进髓核细胞凋亡

流式细胞术、TUNEL和蛋白质印迹法检测结果显示，FGF2重组蛋白显著促进正常大鼠髓核细胞凋亡，增加正常大鼠髓核细胞内凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）表达水平（图2a～f）；采用FGF2中和抗体或siFGF2干预IL-1β预处理的退行性变髓核细胞，细胞凋亡比例及凋亡相关蛋白均显著下调（图2g～r）。上述结果提示FGF2能促进髓核细胞凋亡发生。

2.3 FGF2促进髓核细胞ECM代谢紊乱

实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，FGF2重组蛋白显著减少正常髓核细胞内ECM合成相关基因（ACAN、COL2A1）表达，增加ECM分解相关基因（MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）表达，而FGF2中和抗体或siFGF2对退行性变髓核细胞的作用趋势与之相反（图3）。以上结果说明FGF2对髓核细胞ECM代谢具有抑制合成、促进分解的作用。

2.4 FGF2通过Wnt/β-catenin信号通路调控髓核细胞退变

蛋白质印迹法检测结果显示，activeβ-catenin在FGF2重组蛋白刺激后表达水平显著升高，而FGF2中和抗体或siFGF2可显著降低IL-1β刺激所上调的activeβ-catenin水平；此外，phospho-β-catenin表达趋势与activeβ-catenin相反，总体β-catenin水平变化不明显（图4a、b）。以上结果说明，Wnt/β-catenin信号通路在IDD时显著激活，而这种激活作用可能与FGF2表达升高有关。

为明确Wnt/β-catenin信号通路在FGF2调控IDD中的作用，在FGF2重组蛋白刺激髓核细胞基础上添加Wnt/β-catenin信号通路抑制剂（PRI-724），流式细胞术、TUNEL染色、蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR检测结果显示，在PRI-724作用下，FGF2对髓核细胞引发的促凋亡作用减轻，而FGF2导致的髓核细胞ECM合成减少、降解增加等代谢异常也有所恢复（图4c～j）。以上结果说明Wnt/β-catenin信号通路是介导FGF2调控髓核细胞凋亡和ECM代谢紊乱的重要环节，提示FGF2可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控IDD。

图1 IDD时FGF2表达变化

3、讨论

本研究基于大鼠原代髓核细胞开展细胞及分子实验，通过促炎因子IL-1β诱导髓核细胞退行性变构建IDD细胞模型，结果发现，髓核细胞发生退行性变时FGF2表达水平显著上调，并且FGF2能显著促进髓核细胞凋亡，促进ECM降解代谢、抑制ECM合成代谢。FGF2也称碱性成纤维细胞生长因子（b FGF），是FGF家族的重要成员。人类共有22种FGF蛋白，根据分泌形式分为自分泌、旁分泌和内分泌三大类，其中FGF2通过旁分泌形式发挥作用[10]。FGF2在人体多处组织器官中表达，参与多种疾病的发生、发展。20世纪90年代有学者针对FGF2在IDD中的作用进行研究。Thompson等[11]基于犬组织培养的研究发现，FGF2促进髓核ECM成分蛋白聚糖合成；Nagano等[12]报道FGF2促进大鼠髓核细胞增殖，提示FGF2对椎间盘具有保护作用。然而，部分学者在髓核细胞及关节软骨细胞中发现FGF2抑制ECM合成代谢，促进分解代谢[13,14,15,16]，与本研究结果一致。值得注意的是，IDD的病理表现多样，仅评估FGF2对髓核ECM代谢影响无法明确FGF2对IDD的作用。因此，本研究针对FGF2调控髓核细胞凋亡及ECM代谢展开探索，发现FGF2显著促进髓核细胞凋亡及ECM降解代谢，抑制ECM合成代谢，并由此从细胞层面提出FGF2促进IDD。

图2 FGF2对大鼠髓核细胞凋亡的影响

图3 FGF2对大鼠髓核细胞ECM代谢的影响

2018年，Meo Burt等[8]构建基因过表达小鼠，发现FGF2过表达促进小鼠骨关节炎发生，伴随软骨组织中Wnt/β-catenin信号通路激活；此外，该信号通路抑制剂显著缓解FGF2过表达诱导的骨关节炎表型，提示FGF2正向调控Wnt/β-catenin信号通路，后者在FGF2影响骨关节炎中发挥关键作用。Wnt/β-catenin是生物进化中高度保守的信号通路，参与胚胎发育和组织稳态维持。Wnt/β-catenin信号通路包括细胞膜Wnt信号转导、细胞质β-catenin信号稳定及细胞核靶基因转录调控3部分，当Wnt未被激活时，细胞质内的β-catenin蛋白易被支架蛋白Axin、结肠腺瘤息肉易感蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3(GSK-3）及酪蛋白激酶1(CK1）组成的蛋白降解复合体磷酸化后降解；而Wnt激活可抑制β-catenin蛋白磷酸化，未被磷酸化的β-catenin蛋白在细胞质中稳定存在，并逐步向细胞核内移位，与转录因子T细胞因子/淋巴样增强因子结合，调控靶基因转录[17]。Wnt/β-catenin信号异常与人体多种疾病息息相关，目前认为其对椎间盘的作用主要是通过刺激髓核细胞凋亡，影响ECM代谢平衡等诱导IDD[7]。此外，Xu等[18]发现Wnt/β-catenin信号对终板软骨细胞的退行性变具有促进作用；Hao等[19]在动物体内发现Wnt/β-catenin信号抑制可缓解椎间盘发生退行性变表现，延缓退行性变进程；说明Wnt/β-catenin信号对IDD具有重要影响。本研究发现，Wnt/β-catenin信号在介导FGF2调控髓核细胞凋亡及ECM代谢紊乱中发挥重要作用，如前所述，位于细胞膜的Wnt主要负责细胞内外的信号转导，而FGF2蛋白作为FGF家族旁分泌亚类中一员，通常经由细胞膜FGF受体实现信号转导，Wnt和FGF受体是否存在相互关联尚未见文献报道。本课题组将在后续研究中对FGF2调控髓核细胞及IDD所涉及的细胞信号转导机制深入探索。

图4 Wnt/β-catenin信号通路在FGF2调控IDD中的作用

综上所述，本研究通过动物和细胞实验发现，发生IDD的髓核细胞FGF2表达水平升高，通过Wnt/β-catenin信号通路诱导髓核细胞凋亡及ECM代谢紊乱，从而加剧IDD进程，揭示了FGF2在椎间盘中的促退行性变作用及调控机制，为阐明IDD发生机制提供了理论依据。

参考文献:

[3]马千里,吉应征,孙久一,等.经皮内镜下腰椎间盘切除术后腰椎间盘突出复发的危险因素分析[J].海军军医大学学报,2022,43(10):1170-1175

文章来源:李磊,王一范,施强慧等.成纤维细胞生长因子2在椎间盘退行性变中的作用及机制[J].脊柱外科杂志,2023,21(06):403-410.