中缝背核(dorsal raphe nucleus, DRN)是位于中脑导水管腹侧并呈扇形展开的一个脑干核团。DRN内5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)能神经元占全脑5-HT神经元总量的35%,主要分布于DRN的腹侧及外侧区，是支配前脑5-HT能神经纤维的主要来源[1]。DRN与脑内多个核团存在纤维联系，如前扣带回(anterior cingulate cortex, ACC)、内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex, mPFC)、岛叶(insular cortex, IC)、终纹床核和杏仁中央核(central nucleus, CeA)并参与多种生物学功能。最近的研究表明，DRN投射通路的功能复杂，如DRN-IC投射通路参与痒觉感受[2];DRN-ACC通路参与安慰样行为以及社交能力调控[3];DRN-CeA通路参与慢性痛伴发的抑郁样行为调控[4]。

屏状核(claustrum, CLA)是一个吻尾方向延续较长、呈片状的皮层下结构，位于岛叶皮层和纹状体之间[5]。CLA可分为壳部和中央部[6],其中的神经元分为两类：一类是多棘突的投射神经元；另一类是无棘突的中间神经元。其大多数神经元以谷氨酸为递质，只有10%的神经元以γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)为递质[7]。此外，CLA还表达多种神经调节物质，如钙结合蛋白、血管活性肠肽、生长抑素和神经肽Y等[8]。CLA参与调控疼痛、意识、认知、睡眠等多种生物学功能[9～12]。

DRN是脑干向CLA发出投射的重要核团之一[13]。但迄今为止，该投射通路的形态学特征，包括上游投射神经元的分布、数量、化学神经解剖学特征，下游投射纤维的密度、靶神经元类型等尚不清楚。因此，本研究利用神经束路追踪结合免疫荧光染色，探索了DRN-CLA投射神经通路的形态学特征。

一、材料和方法

1. 材料

1.1 实验动物：

本实验选用6只6～8周雄性C57BL/6小鼠、3只钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium ion/calmodulin protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)-Cre小鼠、3只谷氨酸脱羧酶67(glutamate decarboxylase 67, GAD67)-Cre小鼠，体重18～20 g。动物自由饮食及饮水，饲养室温度维持在22～24 ℃,通风与湿度保持稳定，维持正常的12 h∶12 h昼夜交替光照。所有的实验操作均严格遵守空军军医大学实验动物管理伦理委员会的有关规定和条例，动物生产许可证号：SCXK(陕)2019-001。

1.2 实验试剂与仪器：

594逆向示踪荧光微粒(594 retrobeads, Lumafluor公司),生物素化的葡聚糖胺(biotinylated dextran amine, BDA,Molecular Probes公司),逆行跨单突触狂犬病毒(PT-0021,PT-0023,R01002,武汉枢密脑科学技术有限公司),山羊抗5-HT多克隆抗体(1∶200,AB66047,Abcam公司),Alexa Fluor 488标记的驴抗山羊IgG(1∶400,A11055,Invitrogen公司),FITC-avidin二抗体(1∶400,S11223,Invitrogen公司),小动物脑立体定位仪(瑞沃德生命科技有限公司，中国),1 μl微量注射器(Hamilton公司，美国),冷冻切片机(Leica公司，德国),全玻片扫描系统VS200(Olympus公司，日本),激光共焦显微镜FV1000(Olympus公司，日本)。

2. 方法

2.1 脑立体定位注射：

腹膜腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉小鼠，将小鼠颅顶备皮并固定于小动物脑立体定位仪。头部皮肤消毒后，沿正中线将皮肤剪开。用棉签去除颅骨表面黏膜组织，充分暴露前囟点(bregma)和后囟点(lambda)并校正颅顶平面。用骨钻钻开CLA正上方颅骨，用1 μl微量注射器吸取100 nl 594 retrobeads注入右侧CLA(前囟前方1.10 mm; 中线右侧2.74 mm; 深度3.92 mm)。 用骨钻钻开DRN正上方的颅骨，吸取100 nl BDA注入小鼠DRN(前囟后方4.51 mm; 中线0 mm; 深度3.49 mm)。注射速度20 nl/min, 留针20 min。饲养7 d后灌注固定后取脑。

利用上述同样方法和坐标分别向CaMKⅡ-Cre或GAD67-Cre小鼠的右侧CLA内缓慢注入rAAV-Ef1α-DIO-EGFP-T2A-TVA和rAAV-Ef1α-DIO-N2oG的混合病毒(1∶1混合，共80 nl),结束后留针20 min。小鼠存活21 d后重复相同操作，将RV-EnvA-△G-mCherry注射到右侧CLA(80 nl)。小鼠饲养7 d后灌注固定后取脑。

2.2 灌注取材及切片：

小鼠经腹膜腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，迅速暴露心脏，将针尖迅速插入左心室并剪开右心耳，先快速滴注40 ml 0.01 mol/L PBS冲去血液，之后灌注150 ml含4%多聚甲醛的PB。灌注结束后取出整个脑，放入上述相同固定液中后固定4～6 h, 再换至含30%蔗糖的PB中待脑沉底。将浸糖后的脑用包埋剂包埋后行连续冠状切片(30 μm)。6孔板内倒入0.01 mol/L PBS,所有的切片分6套依次收集于6孔板内备用。注射594 retrobeads的脑切片中的第1套切片在光学显微镜下观察注射位点是否准确和是否有逆行标记神经元。第2套切片行Nissl染色，以确认各核团的位置及境界。其余4套切片用于后续免疫荧光染色。注射BDA的脑切片中的第1套切片在荧光染色之后观察注射位点是否准确，第2套切片行Nissl染色，以确认核团的位置及境界。第3、4套切片用于后续全脑染色和普查，其余2套冷冻保存。注射RV病毒的动物脑切片中的第1套切片在显微镜下观察注射位点是否准确，第2套用于结果展示，其余4套切片冷冻保存。

2.3 免疫荧光染色：

选取594 retrobeads注射区准确，且DRN也能观察到逆行标记神经元的第3、4、5和6套脑切片，行5-HT免疫荧光和省略一抗的对照染色。切片在一抗(山羊抗5-HT抗体，1∶200)孵育液中室温孵育24 h、4 ℃ 48 h(对照染色省略一抗),漂洗(0.01 mol/L PBS,每次10 min)3次后，加入二抗(Alexa Fluor 488标记的驴抗山羊抗体，1∶400)孵育液室温孵育4 h。漂洗3次后，在PBS中按1∶1000孵育DAPI 1 h。漂洗后裱片，待切片自然干燥后用荧光封片剂封片。抗体稀释液配比如下：0.01 mol/L PBS缓冲液中含1%FBS、0.3% Triton X-100、0.12%角叉菜胶、0.02% NaN3,pH 7.4。

选取BDA注射位点准确的动物脑第3、4套切片，用含FITC-avidin(1∶400)的抗体稀释液室温孵育4 h, 切片漂洗3次后裱片，待切片自然干燥后用荧光封片剂封片。

2.4 尼氏染色：

取BDA注射位点准确的第2套切片，用0.01 mol/L PBS漂洗3次后，将切片裱于挂胶载玻片上，待切片干燥后置于75%乙醇，37 ℃烘箱内过夜(脱脂)。取脱脂切片用双蒸水漂洗后，在焦油紫染液中染色约3 min, 通过观察染色深度来调节染色时间。随后用双蒸水洗去焦油紫染液，依次浸入70%、80%、90%、95%乙醇内各3 min, 浸入100%乙醇两次，每次10 min。最后将切片浸入二甲苯中透明，中性树脂封片后，置于通风处干燥。

2.5 结果计数和图片采集：

利用激光共焦显微镜FV1000(Olympus公司，日本)观察和采集免疫荧光染色结果；利用全玻片扫描系统VS200(Olympus公司，日本)观察和采集整张切片的图像。神经元计数范围包括1套切片内所有包含DRN核团的切片，计数时仅计入包含DAPI阳性细胞核的神经元，防止不同切片间同一神经元的反复计入。计数结果采用均值±标准误

二、结果

1. 594 retrobeads逆行标记神经元在脑内分布广泛

将594 retrobeads注入右侧CLA,可见CLA内的示踪剂注射位点准确，少有扩散(图1A)。普查全脑，可在多个脑区观察到密集的逆行标记神经元的胞体：包括皮层的初级运动皮层(primary motor cortex, M1)、初级躯体感觉皮层(primary somatosensory cortex, S1)、内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex, mPFC)的边缘前皮质(prelimbic cortex, PrL)(图1B, 1C),杏仁基底外侧核(basolateral nucleus of amygdala, BLA)(图1D),丘脑室旁核(paraventricular thalamic nucleus, PVT)及周围核团(图1E),黑质致密部(substantia nigra compact part, SNc)(图1F)等。在侧别方面，逆行标记神经元在双侧脑区均有分布，但以同侧脑区分布为主。DRN内的594 retrobeads标记的神经元胞体在核团的吻、中、尾段均有分布(图1G～1I),以中段分布最为显著(图1H)。从亚核分布上看，逆行标记神经元在DRN腹侧部(dorsal raphe nucleus, ventral part, DRV)最为密集，在背侧部(dorsal raphe nucleus, dorsal part, DRD)、外侧部(dorsal raphe nucleus, lateral part, DRL)和束间部较稀疏，神经元形态主要呈长梭形。另外，对6套切片之一的逆行标记神经元进行计数，结果显示，DRN逆行标记的神经元数目平均为(72±4.16)个，见表1。

2. 向CLA投射的DRN神经元多为5-HT阳性神经元

为了观察向CLA投射的DRN神经元的化学性质，对包含DRN核团的切片行5-HT和DAPI免疫荧光染色。结果显示，DRN内分布着密集的5-HT阳性神经元，主要呈圆形和长梭形(图2A, 2E, 2I),省略一抗的对照组染色未观察到阳性染色(结果未显示)。大多数594 retrobeads逆行标记神经元呈5-HT免疫荧光染色阳性(图2B, 2F,2J),594 retrobeads/5-HT双标神经元占逆行标记神经元总数的(92.78±5.32)%(图2I～2L),占5-HT阳性神经元总数的(4.15±0.50)%,见表1。以上结果表明，向CLA投射的神经元类型主要为5-HT阳性神经元，占DRN内5-HT神经元总数的4.15%。

3. BDA顺行标记神经纤维和终末在脑内的分布

将BDA注入小鼠DRN,对切片进行荧光染色并结合Nissl染色可见，BDA注射位点局限于不同层面的DRN内(图3)。普查全脑，可在诸多脑区观察到较为浓密的BDA标记纤维和终末，包括中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)(图4A)、束旁核(parafascicular nucleus, PF)(图4B)、腹侧苍白球(ventral pallidum, VP)(图4C)、外侧下丘脑脚部(peduncular part of lateral hypothalamus, PLH)(图4D)、SNc(图4E)、中缝大核(raphe magnus nucleus, RMg)(图4F)、CeA(图4G)等。与此相比，BDA顺标纤维和终末在CLA内的分布较为稀疏(图4H)。

图1 594 retrobeads在CLA内的注射位点及逆行标记神经元在脑内的分布

表1 DRN内594 retrobeads逆行标记神经元、5-HT能神经元及双标神经元的计数

图2 5-HT能神经元与594 retrobeads逆行标记神经元在DRN的分布

图3 BDA在DRN的注射位点和切片的Nissl染色标尺示200μm

4. DRN投射纤维与CLA内的CaMKⅡ阳性和GABA能神经元形成突触联系

CLA内存在大量兴奋性的锥体神经元以及少量的GABA能神经元[14],为证实DRN投射神经元的下游靶神经元类型，我们在CaMKⅡ-Cre与GAD67-Cre小鼠的右侧CLA分别注射RV三联病毒(图5A)。结果显示，三联病毒的注射位点准确，其中红、绿双标神经元为起始神经元(图5D)。观察逆行跨突触细胞的分布，在CaMKⅡ-Cre小鼠的DRN内存在较密集分布的RV逆行标记神经元，多聚集于DRN的背侧部和腹侧部(图5B,5C),而在GAD67-Cre小鼠的DRN内可观察到稀疏分布的RV逆行标记神经元，且多集中于腹侧部(图5E, 5F)。以上结果说明，来自DRN的投射纤维及终末与CLA内的CaMKⅡ阳性神经元和GABA能神经元均能形成突触联系，但与前者的联系更多。

图4 BDA标记的神经纤维和终末在脑内的分布情况 标尺示100μm

图5 来自DRN的投射纤维与CLA内CaMKⅡ阳性神经元和GABA能神经元形成单突触联系

三、讨论

本实验采用神经束路追踪结合免疫荧光染色，从形态学上揭示了DRN-CLA投射神经通路的上游投射神经元的分布、数量和类型，下游神经纤维分布和靶神经元类型等形态学特征。

CLA与皮层、皮层下、脑干等多个区域存在纤维联系[15,16]。既往研究中，人们将逆行跨单级突触的RV病毒注入到CLA[13,17],结果表明，CLA的大部分传入来自皮层，约占突触前神经元总数的84%,包括眶皮层、内侧前额叶皮层、扣带皮层和内嗅皮层。另外还在BLA、PVT、腹侧海马CA1区、胆碱能基底前脑和DRN内观察到了传入神经元。因此，既往研究表明，DRN-CLA投射神经通路确实存在，但迄今为止，DRN-CLA投射神经元的分段、分区特征及神经元数量等信息并不清楚。本实验中，我们将逆行示踪剂594 retrobeads注入到小鼠的CLA,在M1、S1、PrL、BLA、PVT、SNc等核团观察到了红色荧光标记的神经元，逆行标记神经元在双侧脑区均有分布，但以同侧脑区分布为主。这些普查结果和上述文献报道基本一致。另外，我们在DRN中段的腹侧部观察到了密集分布的594 retrobeads逆行标记神经元，说明DRN向CLA的投射具有节段和亚区特异性。我们还对DRN-CLA投射神经元进行了计数，结果显示，在1/6的切片中神经元总数为72,由此推断，小鼠DRN向CLA投射的神经元总数约为432。DRN向CLA的投射通路也得到了BDA顺行追踪的验证。但与DRN向其他脑区较为密集的纤维终末相比，如VTA、PF、SN、CeA等区域，DRN向CLA的投射纤维量较少。此结果提示，DRN向CLA的投射轴突分支可能较少。

在定位和定量了DRN-CLA投射通路上游神经元的基础上，我们接下来对这条通路的神经化学性质进行了探讨。DRN包含脑内最大的5-HT神经元群体，除此之外还包括GABA能、多巴胺能和谷氨酸能神经元[18]。5-HT免疫荧光染色结果表明，92.78%的逆行标记神经元为5-HT阳性神经元，占DRN内5-HT神经元总数的4%左右。此结果提示，DRN-CLA投射神经通路是以5-HT能投射为主要特征的通路。2016年Muzerelle等[19]利用具有顺行示踪功能的腺病毒特异性标记DRN不同亚区的5-HT神经元，绘制了DRN5-HT与全脑的纤维联系。他们的结果表明，DRV5-HT主要投射至皮层与杏仁核，如M1、S1、CeA、BLA等。DRD5-HT主要投射至下丘脑，而DRL5-HT主要投射至丘脑区域。我们的顺逆行追踪结果补充了他们的研究，指出DRV5-HT还向CLA发出投射。

CLA内存在大量兴奋性的锥体神经元以及少量的GABA能神经元[14],为了揭示DRN-CLA投射神经通路的下游神经元类型，我们利用RV病毒在两种转基因小鼠上证明了DRN的投射神经元终末与CLA内的CaMKⅡ阳性神经元和GABA能神经元均能形成突触联系，但就逆行跨单突触病毒标记神经元的数量来看，其主要与CaMKⅡ阳性的锥体神经元形成突触联系。5-HT受体分为7种亚型，每种亚型又可包含多种亚基。CLA神经元高表达5-HT2A受体[20],中表达5-HT1受体[21]和5-HT3A受体[22]。CLA的部分5-HT受体在睡眠调节中发挥重要作用[23]。本实验揭示了DRN-CLA投射神经通路主要为5-HT能，说明CLA内5-HT受体的功能可能与DRN投射通路有密切关系。另外，越来越多的证据表明，CLA参与痛信息的传递与调节，激活CLA会促进内脏痛[24],CLA病变患者出现痛觉过敏症状[25]。5-HT作为一种典型的神经递质，在控制睡眠、抑郁、疼痛等方面也发挥重要作用[26～28]。DRN-CLA投射神经通路的生物学功能及相关机制有待进一步研究。

参考文献:

[27]吴媛媛,蒋永亮,邵晓梅,等.痛抑郁二联征模型大鼠中缝背核不同水平5羟色胺表达差异[J].解剖学报,2015,46(2):170-174.

基金资助:科技创新2030-“脑科学与类脑研究”重大项目(2021ZD0204403); 国家自然科学基金(82130034,82071253);

文章来源:巩涛,蔡志平,史娟,等.小鼠中缝背核向屏状核投射神经通路的形态学特征[J].解剖学报,2024,55(04):414-421.