柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CVB5)是一种正义单链RNA病毒，属于肠道病毒属(Enterovirus)。CVB5全基因组编码一个多聚蛋白，该多聚蛋白进一步水解为P1、P2和P3三个片段，其中P1区编码VP4、VP2、VP3和VP1结构蛋白，P2区编码2A、2B和2C非结构蛋白，P3区编码3A、3B、3C和3D非结构蛋白[1]。

CVB5可引起呼吸道感染、病毒性心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹、手足口病及I型糖尿病[2]等多种疾病，严重时可致人死亡[3],其所引起的无菌性脑膜炎和病毒性脑炎在亚洲、欧洲、非洲、北美洲和南美洲[4]都有暴发或流行。2014年本实验室在山东省无菌性脑炎患儿粪便中分离并鉴定出一株CVB5毒株[5]。2014年以后，我国云南、福建以及贵州[6,7,8]等地均有CVB5毒株的检出，病例大多集中于手足口病、无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹。值得注意的是，在健康儿童[9]和成人粪便样本[10]中也有CVB5毒株的检出。因此，CVB5依然在全世界持续流行，加之健康婴幼儿能够携带CVB5病毒，对CVB5持续开展病原学监测和基因组分析非常重要。

2020年本实验室对山东省部分地区手足口病样本持续进行病原体检测，成功分离并鉴定到11株CVB5毒株，并通过高通量测序组装获得病毒全长基因组序列，通过同源性比较及系统发育研究，探究了CVB5分离株全基因组和结构蛋白VP1基因的进化特点及分子遗传特征，增加了对CVB5病毒遗传变异的认识，为防控CVB5等肠道病毒引起的手足口病提供了科学依据。

一、材料与方法

1 材料

根据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2009版)[11],采集2020年6-10月山东省部分地区儿童医院门诊手足口病患儿粪便标本共228份，在无菌容器内冷藏运送至实验室，-80 ℃保存。

2 方法

2.1 病毒分离鉴定

取2 g粪便样本置于15 mL离心管中，加入10 mL 磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution, PBS),加入1 g磁珠和1 mL氯仿后剧烈震荡20 min直至样本完全破碎，1 500 g 4 ℃离心20 min后取上清置于新无酶管中。将200 μL粪便悬液接种人喉鳞癌细胞(Human laryngeal carcinoma cell line 2,Hep-2)细胞，待细胞病变程度达90%以上进行收毒。连续传代3次，并取第3次传代后收取的病毒液通过Real-time PCR鉴定肠道病毒，具体步骤为：按照MagaBio plus Virus DNA/RNA Kit试剂盒(购自中国杭州Bioer Technology公司)说明书提取核酸，使用Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒(购自中国上海TOYOBO公司)进行反转录获得cDNA,使用肠道病毒通用上游引物[12](5′-3′):CCTGAATGCGGCTAATCC;下游引物(5′-3′):TTGTCACCATWAGCAGYCA;探针序列：FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-BHQ1检测；反应体系总体积为25 μL,其中包括：2×Pro Taq HS Probe Premix(购自中国上海AG公司)12.5 μL,荧光定量上游引物F(10 μmol/L)1 μL,下游引物R(10 μmol/L)1 μL,探针(10 μmol/L)1 μL,无RNA酶水7.5 μL,待测cDNA模板2 μL;荧光定量PCR反应条件：95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。每个循环结束后检测荧光，同时设立阳性和阴性对照，通过循环阈值(Cycle threshold, Ct)和扩增曲线判读结果，Ct值≤35的样本判定为阳性[11]。荧光定量PCR结果为肠道病毒阳性的细胞培养物，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序。

2.2 全基因组扩增验证

为验证高通量测序结果，根据组装的JN20108H毒株全长序列设计扩增引物(表1),对保存的CVB5样本进行PCR扩增。扩增产物送擎科生物公司进行一代测序，最终基因组序列以验证结果为准。引物设计使用软件Primer Premier, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 CVB5一代测序引物

2.3 生物信息学分析

使用BLAST(http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对本研究所获毒株进行同源检索。自GenBank(http: //www.nvbi.nlm.nih.gov/genbank/)公共数据库下载CVB5全基因组序列及VP1基因全长序列作为参考序列，使用MAFFT v7.490分别进行核苷酸和氨基酸序列比对，使用RaxML v8.2.12构建系统发育树，系统发育分析方法为最大似然法(Maximum likelihood, ML),最佳核苷酸替代模型为GTR(General time reversible model),Bootstrap值设置为1000。

二、结果

1 病毒分离与鉴定

通过对2020年6～10月山东省部分地区儿童医院门诊手足口病患儿粪便标本进行Hep-2细胞培养、Real-time PCR及高通量测序分析，结果从228份样本中成功分离到11株CVB5病毒株。病毒株均采集于山东省内，具体地点包括德州(2株)、济南(8株)和菏泽(1株),患儿性别比例为5∶6(男∶女),患儿年龄均<7岁。信息见表2。

2 全基因组系统进化分析

通过对扩增验证后的病毒基因序列进行BLAST检索，鉴定本研究11株分离株均为CVB5毒株，核苷酸序列长度为7 185～7 276 bp, 5′和3′非翻译区(Untranslated Regions, UTR)之间的开放阅读框(Open reading frame, ORF)长度均为6 558 bp, 编码一个含2 185个氨基酸的多聚蛋白，病毒全基因组结构符合肠道病毒特征。11株序列间核苷酸和氨基酸同源性均较高，达到99.9%～100%。

以GenBank公共数据库中收录的83条CVB5全基因组序列为参考序列，对11株CVB5分离株进行系统发育分析(图1)。结果显示，全基因组系统发育树可划分为5个Group: Group 1(n=2)、Group 2(n=6)、Group 3(n=5)、Group 4(n=36)和Group 5(n=45)。Group 1-3包含CVB5数量较少，其中Group 1包括CVB5原型株Faulkner(1952年)和1株美国分离株(2009年),Group 2包括日本(2006-2007年)、韩国(2000年)、中国(1983年)和罗马尼亚(1970年)分离株，Group 3包括中国(2009-2010年)、澳大利亚(2007年)和德国(2010年)分离株。Group 4和Group 5为近年来CVB5主要流行分支。Group 4中91.7%(33/36)为我国分离株(2008-2020年),其余为美国(2015年)、日本(2015年)和危地马拉(2019年)分离株；Group 5中仅13.3%(6/45)为我国分离株(1972-2019年),86.7%(39/45)为澳大利亚(2008、2017年)、法国(1984、1993年)、瑞士(2015年)、美国(1970-2015年)、日本(2008-2018年)等国家分离株。除了毒株HB_HS,2013年以后国内CVB5分离株仅位于Group 4分支，包括本研究分离鉴定到的11株山东分离株。另外，该11株CVB5分离株与2013年江苏省分离株319、417,2015年日本分离株B509,2017年广东省分离株AFP229和2018年国内分离株B005聚集于同一小分支，核苷酸同源性为95.1%～96.8%。

表2 11株CVB5分离株流行病学信息

3 同源性分析

比较本文分离株与Group 4中参考序列同源性，结果显示，11株CVB5分离株与2013年江苏省分离株417(GenBank序列登录号：KY303900)核苷酸同源性最高，为96.8%。我们进一步比较了11株分离株与Group 4中参考序列各个ORF区段的核苷酸和氨基酸同源性(表3)。结果表明，P3区3A、3B、3C和3D基因核苷酸同源性均低于P1和P2区其他基因，分别为78.3%～98.1%、80.3%～100%、76.5%～96.4%、79.8%～96.2%,氨基酸同源性分别为94.4%～98.9%、95.5%～100%、95.6%～100%、96.3%～99.6%。

4 VP1基因系统进化分析

结合GenBank公共数据库中收录的921条CVB5 VP1参考序列，对本研究分离鉴定的11株CVB5病毒VP1基因进行系统发育分析。参考前期研究中我们对CVB5毒株VP1基因系统进化树的分支划分，本研究中VP1进化树仍划分为A～D 4个基因型(图2)。4个基因型核苷酸的组间距离分别为：21.2%±1.7%(A与B)、21.8%±1.7%(A与C)、28.1%±2.2%(A与D)、19.4%±1.4%(B与C)、26.4%±2.0%(B与D)、26.2%±1.9%(C与D)(表4)。其中基因型A包括CVB5原型株Faulkner、2001年欧洲分离株以及2009年北美洲分离株；基因型B主要包括1983-2011年亚洲分离株以及1970-2006年欧洲分离株；基因型C主要包括1998-2020年亚洲分离株、1996-2015年欧洲分离株、2015-2019年北美洲分离株、2007年大洋洲分离株以及2017年南美洲分离株；基因型D主要包括1972-2018年亚洲分离株、1973-2019年欧洲分离株，1970-2019年北美洲分离株、1991-2017年大洋洲分离株以及2007-2016年南美洲分离株(表5)。上述结果表明，CVB5在全球广泛流行，欧洲和亚洲分离株数量最多(90.4%);2015年后在亚洲和北美洲持续流行的CVB5 VP1基因型包括基因型C和D,国内多为基因型C,2015年后欧洲仅为基因型D。

图1 基于全基因组序列构建CVB5病毒系统进化树

表3 11株CVB5分离株与其他参考毒株基因组各区段同源性(%)

表4 CVB5 VP1序列基因型A-D间的核苷酸遗传距离

表5 CVB5 VP1序列基因型A-D相关序列的年份、地点及数量信息

图2 基于VP1序列的CVB5进化树

三、讨论

CVB5因可导致人类神经系统疾病如无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹、病毒性脑炎以及手足口病、心肌炎和糖尿病等而引起广泛关注，是B组柯萨奇病毒中的主要血清型之一[13]。CVB5在全球范围内流行，1999-2011年韩国一项检测表明CVB5已经成为韩国第三位常见肠道病毒基因型[14],在法国[15]等地也持续有CVB5检出报道。在中国，CVB5与多次儿童无菌性脑炎、病毒性脑炎等聚集性和散发性病例的发生相关。2005和2009年山东省内两次暴发主要由CVB5引起的无菌性脑膜炎疫情[16,17];2011年河南省[18]、2016-2018年河北省[19]和2023年云南省[20]等地散发的脑炎病例中均有CVB5检出。2014年本实验室[5]在山东省无菌性脑炎患儿粪便中也曾鉴定到CVB5毒株感染。在本研究中自2020年6～10月在山东省采集的手足口病患儿粪便样本中分离出了11株CVB5毒株。因此，CVB5在山东省尤其在婴幼儿中长期持续流行。

2008-2014年GenBank数据库收录的CVB5全基因组仅20条[5],到目前为止收录数量已增加至83条。基于病毒全基因组系统发育分析表明，全球流行的CVB5毒株已呈现一定的遗传多样性，演化为Group 1-Group 5分支，这五个分支毒株分离地点均覆盖多个国家或地区，提示存在CVB5毒株频繁跨地区传播，导致各分支CVB5毒株在全球范围内流行。中国CVB5毒株全基因组在Group 3、Group 4和Group 5中均有分布。包括本研究发现的11株分离株在内的2008-2020年国内毒株大多位于Group 4中，说明Group 4为国内CVB5毒株全基因组优势流行分支。不同的是，Group 5分支多为澳大利亚、法国、瑞士、美国、日本等国家分离株(86.7%),在国内或为有限传播(13.3%)。但考虑到CVB5毒株全基因组序列数量仍然有限，因此对Group 5分支CVB5毒株在国内的流行情况还需进一步关注。

CVB5基因组为单股正链RNA,结构蛋白VP1-VP4均由P1区编码，而病毒复制所需的非结构蛋白由P2和P3区编码[1]。He等[4]发现相较于P1区，CVB5毒株P2和P3区表现出显著差异。本研究CVB5分离株与Group 4中其他CVB5基因组比较，P3区3A、3B、3C和3D基因明显不同，核苷酸同源性均低于其他蛋白编码区，即在CVB5毒株P3区表现出核苷酸遗传距离大于氨基酸遗传距离的现象，推测CVB5在P3区的核苷酸差异多为同义突变。非结构蛋白编码区频繁观察到同义突变这一现象，已在CVA2、CVA4、CVA6、CVA10和CVA12等多种亚型肠道病毒[21]被观察到。许丹菡等[22]在国内大陆CVB5流行株全基因组中也发现其进化过程有同义突变的积累。

结构蛋白VP1暴露在肠道病毒衣壳表面，是主要的表面抗原决定簇区，通常将编码VP1的基因作为肠道病毒分子分型的靶标序列[23]。在前期研究中[5],根据CVB5毒株VP1基因的系统进化特征，将该病毒VP1基因划分为A～D四个基因型，又将基因型C划分为C0～C4 5个基因亚型，这一分支命名系统同样适用于本研究VP1基因系统进化树。研究发现，截止目前，GenBank数据库收录的全球931条CVB5毒株VP1基因以亚洲和欧洲分离株居多，这与之前研究一致[4],2003年以后基因型C和基因型D在亚洲和欧洲持续流行，基因型C中80.3%为亚洲分离株序列，基因型D中72.1%为欧洲分离株序列，提示亚洲和欧洲CVB5毒株VP1基因或具有明显的基因型特征。近几年国内CVB5新分离株VP1基因也多位于基因型C中，最新序列记录截止到2020年，说明基因型C为当前国内VP1基因主要流行亚型，尤其近十年国内CVB5毒株VP1基因几乎全部分布在C4基因亚型中，这与前期研究所揭示的C4基因亚型为我国主要流行亚型的结论一致[5]。前期研究还发现C3、C4在山东省共同流行[5],而本研究结果显示，2011年后C3基因亚型病毒在山东省及国内其他省份均没有再被检出，提示山东省当前流行亚型或仅为C4基因亚型。另外，本研究所分离得到的11株山东分离株与近十年国内分离株的全基因组和VP1基因均在同一分支，表明本研究11株分离株为近期国内流行株。

综上，本研究基于2020年11株山东省CVB5临床样本分离株的遗传特征，总结了目前公共数据库所收录全球所有CVB5全基因组及VP1基因的系统进化特征，丰富了CVB5毒株的基因组库信息，增加了对CVB5毒株遗传进化特征的了解，为深入研究CVB5遗传变异机制及为相关疾病的防控提供了理论参考。

参考文献:

[5]王敏,韦庆娟,李娟,等.2014年山东省1株柯萨奇病毒B5分离株全基因序列分析[J].中华预防医学杂志,2018,52 (2):185-187.

[6]朱艳菊.2009-2010年云南省肠道病毒相关无菌性脑炎的分子流行学研究[D].北京协和医学院,2016.

[7]何春荣,吴水新,何云,等.2011-2013年龙岩市手足口病流行病学及病原学特征分析[J].现代预防医学,2015,42(17):3079-3081.

[8]李俞亭.贵州省部分地区手足口病流行病学及病原学研究[D].贵州医科大学,2018.

[9]何云,李美华,廖亦红,等.2013､2014年龙岩市健康儿童肠道病毒携带状况调查[J].预防医学论坛,2017,23(4):251-253.

[10]田会方,张勇,李秀娟,等.河北省石家庄市手足口病流行中健康人肠道病毒带毒情况及病原分析[J].病毒学报,2017,33(3):395-403.

[11]中华人民共和国卫生部.手足口预防控制指南(2009年版)[J].全科医学临床与教育,2010,16(2):125-127.

[17]王海岩,李岩,徐爱强,等.柯萨奇B5病毒引起山东省一起无菌性脑膜炎暴发的鉴定及其亲缘进化分析[J].中华流行病学杂志,2010,31(1):64-68.

[18]马红霞,潘静静,康锴,等.2011年河南省脑炎患者柯萨奇病毒B5型分离株基因组序列分析[J].中华流行病学杂志,2013,34(12):1213-1215.

[19]雷延龄,蒋秀芳,褚丽敏,等.2016-2018河北地区儿童病毒性脑炎流行特征调查[J].中国病原生物学杂志,2019,14(12):1433-1437.

[21]姚雪,谢彬,韦庆娟,等.柯萨奇A2､A4､A6､A10和A12型病毒的密码子使用偏好性分析[J].病毒学报,2023,39(1):75-86.

[22]许丹菡,郭伟,张名,等.一株柯萨奇病毒B组5型分离株V1641/YN/CHN/2016的全基因序列分析[J].病毒学报,2022,38(3):573-580.

基金资助:国家自然科学基金(No.81902065); 山东省自然科学基金(No.ZR2018PH034); 泰山学者工程专项(No.tsqn202211217); 山东第一医科大学“学术提升计划”(No.2019QL006);

文章来源:曹梦圆,崔亚楠,王敏,等.柯萨奇病毒B组5型山东分离株基因特征分析[J].中国病原生物学杂志,2024,19(06):659-664+670.