牙周炎和糖尿病是两大影响全球健康问题的常见病、多发病，两者具有双向促进作用[1]。伴糖尿病牙周炎具有以下临床特点，如菌斑控制困难、组织破坏严重、基础治疗效果难以维持[2]。在临床上，糖尿病往往导致更严重的全身炎症，加重牙周组织炎症，进而促使致病菌的侵入，不利于血糖控制[3]。人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)在牙周组织改建和损伤修复中发挥重要作用[4],并且可以分化成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等不同类型，同时具备强大的增殖能力[5]。体外研究表明，在伴糖尿病牙周炎的高血糖状态下，hPDLSCs的成骨能力降低[6]。高血糖、晚期糖基化终末产物、炎症和氧化应激等因素在其中起到关键作用，类似于其他糖尿病并发症。但是关于高糖炎性环境下hPDLSCs成骨能力受影响的机制尚不明确，有待进一步探讨。

Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)是一种重要的转录因子，在多种细胞类型中发挥关键调控作用。近年来，研究者们开始关注KLF4在炎性环境下对干细胞的调控作用[7]。有研究表明，KLF4在干细胞中的表达与干细胞的自我更新和分化能力密切相关[8]。同时，能量代谢在维持细胞功能和生存中起着重要作用，包括葡萄糖代谢、脂肪酸代谢和线粒体功能等方面的调控[9],KLF4在炎性环境下的调控作用可能是通过调节干细胞的能量代谢途径。基于此，本研究旨在探索高糖炎性环境下KLF4对hPDLSCs能量代谢以及成骨分化的影响，以期为伴糖尿病牙周炎患者的治疗提供新的理论依据。

1、材料与方法

1.1主要试剂

低糖、高糖DMEM培养基(Gibco,美国),牙龈卟啉单胞菌脂多糖(lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis-LPS)(InvivoGen,美国),KLF4抗体、β-actin抗体、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)抗体、骨钙素(osteocalcin, OCN)抗体、GAPDH抗体(Abcam,美国),茜素红(Sigma,美国),BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测试剂盒(上海碧云天),阴性对照慢病毒、KLF4过表达慢病毒、KLF4敲低慢病毒(上海吉凯),RNA提取试剂盒、qRT-PCR试剂盒(Takara,日本),核酸酶靶向切割和释放(cleavage under targets and release using nuclease, CUT&RUN)试剂盒(南京诺唯赞)。

1.2方法

1.2.1实验分组

课题组前期研究已成功提取并鉴定hPDLSCs[10]。使用P3代的hPDLSCs用于后续实验。本实验将hPDLSCs分为对照组、高糖(HG)组、炎症(LPS)组和高糖炎症(HG+LPS)组。使用葡萄糖浓度为25 mmol/L的高糖培养基模拟体内高血糖环境，使用葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的低糖培养基模拟体内正常血糖环境[11]。使用P. gingivalis-LPS诱导hPDLSCs模拟牙周炎环境[12]。对照组与LPS组使用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1%青霉素-链霉素的低糖DMEM培养基培养；HG组与HG+LPS组使用含10% FBS、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基培养；LPS组与HG+LPS组使用浓度为10μg/mL的P. gingivalis-LPS加入培养基刺激细胞48 h后，进行后续实验。

1.2.2免疫荧光染色

将1.2.1中各组hPDLSCs接种于6孔共聚焦板中，培养48 h后使用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100进行渗透化处理，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤，兔血清封闭标本20～30 min; PBS洗涤，KLF4一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤，使用荧光标记的二抗孵育后，倒置荧光显微镜观察并摄片，使用Image J分析相对荧光强度。

1.2.3 Western blot检测KLF4与成骨相关蛋白表达

使用全蛋白提取试剂盒进行提取1.2.1中各组hPDLSCs蛋白，测定蛋白样品浓度。将蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶，进行电泳分离；转膜后，室温下加入封闭液，加入KLF4、β-actin、RUNX2、OCN、GAPDH一抗(均1∶1 000)4℃孵育过夜。β-actin作为KLF4检测内参蛋白，GAPDH为RUNX2、OCN检测内参蛋白。加入二抗(1∶10 000),将膜置于ECL曝光液中，使用发光凝胶成像系统拍摄记录，使用Image J对蛋白条带进行灰度值分析。

1.2.4 hPDLSCs成骨诱导与ALP、茜素红染色

将1.2.1中各组hPDLSCs均匀铺在12孔板内，当细胞密度达50%～70%时，将培养基更换为成骨诱导培养基，每3 d换液，观察细胞形态的变化。在成骨诱导3～5 d后，使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒按照说明书对细胞进行染色，显微镜观察并拍摄。使用ALP活性检测试剂盒按照说明书对细胞进行ALP半定量检测，使用多功能酶标仪在波长450 nm处测量光密度(optical density, OD)值。

在成骨诱导12～16 d后对细胞进行茜素红染色，完成染色后，每孔添加10%氯化十六烷基吡啶(cetylpyridine chloride, CPC)溶液，37℃孵育30 min促进溶解并进行震荡，测量波长450 nm处的OD值。

1.2.5慢病毒感染

将hPDLSCs细胞接种于培养皿中，分别用阴性对照慢病毒、KLF4过表达慢病毒与KLF4敲低慢病毒进行转染细胞：感染前，用完全培养基配制感染液备用，吸掉旧培养基，更换为感染液，并参考细胞感染复数值，计算病毒使用量，加入病毒进行感染、混匀；病毒感染8～16 h后，换常规培养基，继续培养；感染72 h后，显微镜下观察细胞发出绿色荧光的强弱判断感染效率。

1.2.6实时荧光定量PCR与Western blot检测慢病毒感染后KLF4 mRNA与蛋白表达水平

实验分组同1.2.5,慢病毒感染72 h后使用RNA提取试剂盒提取hPDLSCs总RNA,接着用Takara反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。使用qRT-PCR试剂盒进行PCR扩增，以GAPDH作为内参检测KLF4的mRNA相对表达量，计算方法为2-ΔΔCt。KLF4上游引物序列：5′-TACCAAGAGCTCATGCCACC-3′,下游引物序列：5′-AAGGTTTCTCACCTGTGTGG-3′;GAPDH上游引物序列：5′-TCAAGGCTGAGAACGGGAAG-3′,下游引物序列：5′-CGCCCCACTTGATTTTGGAG-3′。Western blot检测慢病毒感染后各组hPDLSCs KLF4蛋白表达水平，步骤同1.2.3。

1.2.7慢病毒感染后hPDLSCs成骨能力检测

实验分组同1.2.5,将慢病毒感染后的hPDLSCs均匀铺在12孔板，对hPDLSCs进行成骨诱导，使用ALP、茜素红染色检测成骨能力，步骤同1.2.4。

1.2.8 CUT&RUN测序分析

使用CUT&RUN试剂盒对1.2.1中对照组与HG+LPS组hPDLSCs进行建库。收集细胞并洗涤，加适当稀释后的KLF4抗体，4℃孵育过夜。用冷PBS洗涤细胞；添加微球菌核酸酶复合物4℃条件下旋转孵育1 h;加入CaCl2进行片段化，冰上孵育60～90 min;加入终止缓冲液。收集释放的DNA,并对其扩增构建文库。对文库进行质量检测后上机测序，并进行后续的生信分析。使用R studio 4.5软件中的DESeq2 1.38.0进行差异峰分析，clusterProfiler 4.2.0进行GO/KEGG功能富集分析。

1.2.9 Seahorse能量代谢检测

实验分组同1.2.5,将慢病毒感染后的hPDLSCs均匀地接种于Seahorse测定板中的各个孔中，每孔细胞计数为1×104个。将Seahorse测定板放入预热的Seahorse仪器中，使细胞适应37℃的温度。适应完成后，将酸化和氧化代谢测定介质加入到测定板的各孔中，设置测定程序，测量间隔时间点的线粒体耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)和细胞外酸化率(extracellular acidification rate, ECAR)以及线粒体基础耗氧量、质子漏耗氧量、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)源性耗氧量等线粒体呼吸的各项指标。导出数据，并进行后续分析。

1.3统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布与方差齐性。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1高糖炎性环境下KLF4蛋白表达情况

利用免疫荧光染色对KLF4进行定位与表达水平分析，结果显示：对照组中KLF4主要分布在细胞核中，HG组KLF4在细胞核和细胞质中均有分布，LPS组KLF4在细胞核与细胞质中的分布均减少，HG+LPS组KLF4荧光信号较弱，几乎无法检测(图1A);荧光强度分析结果显示：相比于对照组、HG组和LPS组，HG+LPS组KLF4荧光强度下调(P<0.05,图1B)。提示高糖炎性条件下，KLF4的定位发生了变化，蛋白表达水平下调。

Western blot对KLF4蛋白表达水平进行进一步验证(图2A、B),结果表明HG+LPS组中hPDLSCs的KLF4蛋白表达水平低于对照组、HG组与LPS组(P<0.01)。提示在高糖炎性环境下，KLF4蛋白表达水平下调。

2.2高糖炎性环境下hPDLSCs的成骨分化能力下降

观察hPDLSCs在高糖炎症状态下成骨分化能力的变化，进行ALP染色，结果显示：与对照组比较，LPS组ALP染色程度较浅，HG+LPS组ALP染色程度比LPS组更浅(图3A)。半定量分析结果显示：与对照组、LPS组和HG组比较，HG+LPS组ALP活性降低(P<0.001,图3B)。茜素红染色结果显示：LPS组的钙结节形成较对照组减少，而HG+LPS组钙结节的形成相较LPS组和HG组更少(图4A)。CPC半定量分析显示：HG+LPS组的OD值低于对照组、HG组与LPS组(P<0.001,图4B)。

图1高糖炎性环境下KLF4表达的免疫荧光染色 

图2 Western blot检测高糖炎症环境中KLF4的蛋白表达水平

Western blot检测hPDLSCs成骨分化相关蛋白表达的结果显示：与对照组相比，HG组成骨分化相关蛋白表达水平无显著改变(P>0.05),而HG+LPS组的RUNX2和OCN蛋白表达水平低于对照组、HG组与LPS组(P<0.01,图5A、B)。

2.3 KLF4影响hPDLSCs成骨分化能力

为了研究KLF4对hPDLSCs成骨能力的调节作用，将KLF4进行敲低和过表达处理。实时荧光定量PCR和Western blot实验结果显示：与阴性对照组相比，KLF4过表达组KLF4 mRNA和蛋白的表达水平升高，KLF4敲低组KLF4 mRNA和蛋白的表达水平降低(P<0.01,图6A～C)。

图3高糖炎性环境下hPDLSCs的ALP活性  

图4高糖炎性环境下hPDLSCs的茜素红染色 

图5 Western blot检测高糖炎性环境下hPDLSCs成骨相关蛋白表达水平  

图6实时荧光定量PCR与Western blot检测慢病毒转染后KLF4的表达  

ALP相关实验结果显示：与阴性对照组相比，KLF4敲低组的ALP染色程度变浅，ALP活性受到抑制，而KLF4过表达组的ALP染色程度加深，ALP活性增强(P<0.001,图7A～D)。茜素红染色与半定量分析结果显示：与阴性对照组相比，KLF4敲低组的钙结节形成较少，OD值降低；而KLF4过表达组的钙结节形成较多，OD值增加(P<0.001,图8A～D)。提示敲低KLF4会导致hPDLSCs的成骨能力受损，而过表达KLF4则能增强hPDLSCs的成骨能力。

2.4 CUT&RUN测序分析结果

为了深入研究高糖炎性刺激对hPDLSCs成骨能力的影响机制，采用CUT&RUN实验技术分析KLF4与DNA之间的相互作用。对差异峰区域的信号富集程度进行可视化热图，热图显示不同分组样本在差异上调和下调的峰中心点的信号谱分布，结果显示对照组与HG+LPS组峰区域的信号富集有差异(图9A)。对差异分析的结果使用火山图可视化，结果显示对照组与HG+LPS组共有19 412个差异峰基因上调及15 960个差异峰基因下调(图9B)。为了探索差异峰基因与化学、基因组和系统功能等相关的通路进行KEGG分析，结果显示差异基因富集于2型糖尿病、胰岛素信号通路等能量代谢通路(图9C)。为了找出差异峰基因中与基因和蛋白质功能相关的通路进行GO富集分析，结果显示，差异基因富集于细胞对胰岛素刺激的反应、负调控磷酸盐代谢等能量代谢通路，Wnt信号通路、干细胞分化等细胞增殖分化相关通路及成骨相关通路(图9D)。这提示高糖炎性环境下hPDLSCs中的KLF4对能量代谢通路有影响。根据CUT&RUN测序分析的实验结果，初步确定高糖炎性环境下，hPDLSCs的能量代谢发生了改变。

图7慢病毒转染后hPDLSCs的ALP活性 

图8慢病毒转染后hPDLSCs的茜素红染色

2.5 KLF4影响细胞能量代谢途径

为了进一步探究KLF4是否通过调节能量代谢途径从而影响hPDLSCs,使用Seahorse能量代谢仪检测hPDLSCs的氧化呼吸能力，通过测量OCR和ECAR分别评估线粒体的氧化磷酸化水平和糖酵解水平。结果显示，KLF4敲低组的OCR水平低于阴性对照组，而ECAR水平高于阴性对照组；KLF4过表达组的OCR水平高于阴性对照组，而ECAR水平低于阴性对照组(图10A、B)。与阴性对照组相比，KLF4敲低组线粒体基础耗氧量、ATP源性耗氧量均下调，同时质子漏耗氧量增加(P<0.05,图10C)。提示KLF4敲低导致hPDLSCs能量代谢受损，糖酵解上调，产能水平下调；而KLF4过表达则能够恢复hPDLSCs的能量代谢，使氧化磷酸化上调，产能水平上调。

3、讨 论

牙周炎与糖尿病之间存在着密切的关系，研究表明，相较于非糖尿病人群，糖尿病患者患牙周炎的风险增加34%[13]。糖尿病中的高血糖会导致晚期糖基化终产物(advanced glycation end product, AGE)的不可逆形成，激活AGE受体通路，对细胞产生直接的促炎和促氧化作用，导致牙周组织破坏更严重[14]。此外，糖尿病患者牙周组织中促炎因子水平的升高可能会促进牙周组织的破坏[15]。有证据表明，在牙周炎患者中白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α等炎症介质升高，导致全身炎症。这种全身炎症反应会导致胰岛素抵抗，并最终对糖尿病患者的血糖控制和并发症产生不利影响[16]。对于合并糖尿病的牙周炎患者来说，牙周组织再生能力受损，进行非手术治疗后，牙周组织的愈合过程可能会延缓[17]。因此，伴糖尿病牙周炎的治疗除了完善的非手术治疗和严密的血糖控制以外，还需要考虑恢复牙周组织的改建和再生潜能。

hPDLSCs在维持牙周组织稳态和修复过程中发挥着重要的作用[18]。成骨能力是hPDLSCs的重要功能之一[19],成骨能力的降低可能导致牙周疾病的发展和牙槽骨丧失[20]。因此，维持hPDLSCs的健康状态和促进其成骨能力对于保持牙周组织的健康和功能至关重要。然而，高糖环境可以抑制hPDLSCs的增殖能力，促进其凋亡的发生，并降低其分化为成骨细胞的能力[11]。在高血糖和炎性刺激下，牙周组织中的巨噬细胞会发生焦亡[21]。高浓度的葡萄糖增强免疫细胞的促炎细胞因子表达，诱导核转录因子-κB通路的活化[22]。这些影响可能与伴糖尿病牙周炎的发生和发展密切相关。在本研究中，通过ALP染色、茜素红染色以及成骨分化相关蛋白的检测，验证了高糖炎性环境能够抑制hPDLSCs的成骨分化能力，并初步探索其成骨能力受影响的潜在机制。

图9 CUT&RUN分析高糖炎性环境下hPDLSCs中KLF4与DNA之间的相互作用

KLF4作为转录因子，在多种生理过程中发挥重要功能[23]。上调KLF4可以促进衰老细胞更新及组织再生[24],而KLF4下调引发节律紊乱，导致免疫系统衰老[25]。但KLF4对于hPDLSCs功能的影响还未见报道。本研究发现高糖炎性条件下hPDLSCs中KLF4的表达水平降低。KLF4参与维持干细胞的自我更新能力，促进细胞分化，并参与组织的再生修复过程[26]。本研究通过过表达KLF4,发现KLF4的上调会促进hPDLSCs的成骨分化。因此，上调KLF4可能通过恢复高糖炎性环境下hPDLSCs受损的成骨分化功能，进而促进牙周组织的修复和再生。

KLF4对线粒体呼吸链功能的维持和调节具有重要作用。研究表明，KLF4的缺乏会导致线粒体呼吸链复合物的组装和功能受损，影响线粒体的ATP产生和细胞的能量代谢[27]。在内皮细胞中，脉冲剪切应力可以诱导KLF4的表达，并增加葡萄糖激酶调节蛋白的表达，同时抑制糖酵解基因的表达[28]。此外，KLF4的激活还可以促进细胞的线粒体能量代谢途径，并维持胃上皮祖细胞的干性[29]。然而先前的研究尚未证明KLF4是否能够通过调节能量代谢进而影响hPDLSCs。本研究利用CUT&RUN技术对高糖炎性环境下hPDLSCs中KLF4结合的DNA进行测序与通路富集分析，发现差异基因富集于各类能量代谢通路、细胞增殖分化、成骨等相关通路。这表明高糖炎性环境可能通过改变细胞内的能量代谢途径来影响hPDLSCs的功能和生理过程。同时还发现，敲低KLF4影响hPDLSCs的线粒体能量代谢，并导致氧化磷酸化水平下降，而过表达KLF4能够上调hPDLSCs的氧化磷酸化水平，这一结果与之前文献[29]报道一致，说明激活KLF4可以通过上调氧化磷酸化影响hPDLSCs。

图10 KLF4影响hPDLSCs能量代谢途径  

能量代谢在干细胞的分化过程中起着重要作用。在体外间充质干细胞成骨分化过程中，能量代谢可从糖酵解转变为线粒体氧化磷酸化[30]。此外，有研究表明通过上调氧化磷酸化能促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化[31]。因此，KLF4的降低导致hPDLSCs的能量代谢受损，可能是其成骨分化功能下降的原因之一。通过上调KLF4提高氧化磷酸化水平，可能作为恢复hPDLSCs成骨分化能力的潜在治疗靶点。

综上所述，本研究揭示KLF4在高糖炎性环境下调控hPDLSCs能量代谢的机制。这一发现有助于更好地理解高糖炎性环境对hPDLSCs功能和生理过程的影响，为伴糖尿病牙周炎的治疗和预防提供新的思路和理论基础。

基金资助:国家自然科学基金(82170962,82370961);江苏省科教能力提升工程——江苏省研究型医院(YJXYYJSDW4);江苏省医学创新中心(CXZX202227);

文章来源:唐婧淇,徐萱雯,周逸,等.高糖炎性环境下KLF4调控人牙周膜干细胞能量代谢的机制初探[J].口腔生物医学,2024,15(02):82-90.