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氟暴露对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

2020-09-17 112 上传者：管理员

摘要：目的:探讨氟暴露对牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响。方法:从人牙周膜组织中分离、培养得到PDLSCs,取第3代细胞行流式细胞分析干细胞表面标志物。分别用含0.1、1、10、20、40mg/L的含氟培养基进行培养,检测不同浓度氟对PDLSCs细胞增殖(CCK-8法)、集落形成、细胞周期变化(流式细胞分析)、成骨分化能力(茜素红染色及Westernblot分析ALP及RUNX2的蛋白表达水平)的影响。结果:氟暴露对PDLSCs增殖与成骨分化的影响呈浓度及时间依赖性。0.1～10mg/L氟对PDLSCs增殖无显著影响(P>0.05),但0.1及1mg/L氟可显著促进其成骨分化,表现为钙化结节增多(P<0.05),ALP及RUNX2蛋白表达水平升高(P<0.05)。高浓度氟(20、40mg/L)显著抑制PDLSCs增殖(P<0.05),具有较强的细胞毒性。结论:氟暴露会影响PDLSCs的增殖与成骨分化。高浓度氟抑制PDLSCs增殖,而氟浓度较低时(0.1、1mg/L)对PDLSCs增殖无显著影响,并可以促进细胞成骨分化。

关键词：
口腔医学
氟暴露
牙周膜间充质干细胞
细胞分化
细胞增殖
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氟广泛存在于自然界和生物体内,是一种化学性质活泼的元素。低剂量的氟对于动物牙齿和骨的正常发育与代谢必不可少;而长时间、高剂量摄入氟会影响机体的生物矿化,造成氟骨症、氟牙症等疾病[1]。此外,氟可能通过多种机制对全身各器官、组织及细胞产生毒性,如内源性线粒体凋亡途径、外源性凋亡途径、内质网应激、氧化应激等;但其确切的机制尚未明确[1,2,3]。以往口腔医学界对氟暴露的研究主要集中在氟对造釉细胞及骨细胞的毒性损伤[2,3,4],而对牙周膜干细胞的影响鲜见报道。PDLSCs是牙周组织再生的关键种子细胞,一系列因素(如年龄、激素调节、低氧等)可以影响其增殖与分化[5,6,7]。饮水、含氟牙科材料及防龋制剂的使用均可使牙周组织处于不同剂量的氟暴露下[1]。本研究通过体外细胞实验,研究氟暴露对人PDLSCs增殖与成骨分化的影响,为PDLSCs的临床应用提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

氟化钠(NaF)、Ⅰ型胶原酶、分散酶(Sigma-Aldrich,美国);鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-PE(BioLegend,美国);α-MEM培养基及胎牛血清(FBS)(Hyclone,美国);CCK-8试剂、碘化丙啶(PI)细胞周期试剂盒、胰酶(上海碧云天);茜素红(北京索莱宝科技有限公司);DMSO(Amresco,美国);Super-SignalWestPico化学发光底物(Thermo,美国);抗Runt相关转录因子2(Runt-relatedtranscriptionfactor2,RUNX2)多克隆抗体(1∶1000,Abcam,美国);抗碱性磷酸酶(alkalinephosphatas,ALP)多克隆抗体(1∶1000,Abcam,美国);抗β-肌动蛋白(β-actin,1∶1000,BioLegend,美国);70μm孔径尼龙细胞筛(BD,美国);倒置相差显微镜及照相系统(Olympus,日本);UVPChemStudioPlus多功能化学发光成像系统(AnalytikJena,德国);流式细胞分析仪(BDCalibur,美国)。

1.2实验方法

1.2.1PDLSCs的分离、培养及氟暴露处理

从口腔科门诊采集因阻生拔除的第三磨牙。PBS清洗后立即在无菌条件下用手术刀片刮下根中1/3根面的牙周膜,切碎后放入含3g/LⅠ型胶原酶及4g/L分散酶的α-MEM培养基37℃水浴下消化15min,70μm孔径细胞筛过滤得到单细胞悬液,置入37℃、5%CO2条件下用含15%FBS的α-MEM培养基进行培养,每周换液2次。细胞融合达80%时用2.5g/L胰酶消化传代,取第3代细胞用于以下实验。细胞被分为多个浓度组,在融合度80%时分别加入NaF,使培养基中氟的终浓度为0、0.1、1、10、20或40mg/L。

1.2.2流式细胞分析

①为了分析PDLSCs表面干细胞标志物,用PBS将PDLSCs重悬为1×106/mL的细胞密度,每个离心管加100μL细胞悬液,分别加2μL鼠抗人CD29-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE单克隆流式抗体,4℃避光孵育30min。PBS洗3次,最后重悬于500μL含0.5%FBS的PBS中流式分析。②为了检测细胞周期,采集不同浓度氟暴露组PDLSCs制成单细胞悬液,调整细胞密度为1×106/mL,离心后加-20℃预冷75%乙醇溶液,并在4℃固定过夜,离心后洗涤细胞2次;加入10g/L碘化丙啶(PI)10μL,10μg/LRNA酶抑制剂10μL,4℃避光孵育30min,流式细胞仪进行检测,modfitLT3.1软件(VeritySoftwareHouse公司,美国)进行细胞周期分析。

1.2.3成骨诱导培养

将PDLSCs接种于6孔培养板进行细胞培养,到融合度达50%时,换用含50mg/L抗坏血酸、0.1mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油酸钠的成骨培养液进行成骨诱导4周,茜素红染色观察矿化结节,ImageJ软件分析红色的矿化结节区所占的面积百分比来评估其成骨能力。诱导培养基中加入不同剂量NaF以达到0.1、1及10mg/L氟的终浓度,构成不同浓度氟暴露组。

1.2.4CCK-8法分析的细胞增殖

将第3代PDLSCs配制成2×103/mL密度的单细胞悬液,以每孔100μL接种到96孔板,第1、3、5及7天后弃培养液,PBS冲洗3遍,加入CCK-8孵育2h,酶标仪450nm波长检测A值。

1.2.5克隆形成检测

取对数生长期的第3代PDLSCs,2.5g/L胰酶消化并制成单细胞悬液后,将1×103个细胞接种到直径为6cm的培养皿,用含15%FBS的培养液培养14d,吸去培养液,PBS洗2遍,4%多聚甲醛固定30min,结晶紫染色后用多功能化学发光凝胶成像系统分析克隆形成数(细胞数目大于50个的克隆记为1个阳性克隆)。

1.2.6Westernblot分析

PDLSCs经成骨诱导后7d后采集各组细胞,PBS漂洗后加入含PMSF的RIPA裂解液200μL冰上裂解细胞,4℃下12000r/min离心15min,取上清液,BCA法测量蛋白浓度。各氟暴露组中取等量细胞蛋白进行SDS-PAGE。电泳结束后将凝胶中的蛋白转到PVDF膜上,依次用一抗(分别为抗RUNX2及ALP抗体)和HRP标记二抗进行免疫杂交反应,以β-actin为内参。最后将PVDF膜进行ECL化学发光反应,再用多功能化学发光凝胶成像系统对电泳蛋白条带进行拍摄及分析。

1.3统计学分析

上述实验至少进行3次重复独立试验。SPSS13.0进行统计学分析。3组间均数的比较采用单因素方差分析,Tukey检验比较两两差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1氟暴露对PDLSCs细胞形态的影响

分离、培养出了PDLSCs;它们呈纤维细胞样,在塑料培养皿底部贴壁生长。流式细胞分析显示,造血干细胞表面标志分子CD34、CD45均为阴性(表达率分别为0.24%及0.12%),间充质干细胞表面标志分子CD29、CD90、CD105呈阳性(表达率分别为97.7%、93.8%及30.8%)。在诱导培养基条件下,均能向成骨及成脂方向诱导分化。

倒置显微镜下观察可见,0.1～10×10-6mg/L氟处理细胞48h对细胞形态无明显影响;而20及40mg/L氟显著改变PDLSCs的细胞形态。原先的梭形、长条形的细胞长度缩短,变得扁平样;部分细胞贴壁能力下降,有的甚至收缩成圆形,并漂浮起来,并形成凋亡小体;细胞密度也明显下降(图1)。

2.2不同浓度氟对PDLSCs增殖及细胞周期的影响

CCK-8细胞增殖分析显示,0.1～10mg/L氟对细胞活力无抑制作用,当氟浓度≥20mg/L,会显著抑制细胞活力(P<0.05,图2a)。克隆形成实验可以反映细胞的长期增殖能力,结果与CCK-8分析结果相似;20mg/L氟使克隆形成数平均较少约49.1%[对照组克隆数均值为(131.0±15.7),20mg/L组为(66.7±31.5)],而40mg/L氟完全阻断了细胞集落的形成(图2c)。细胞周期分析提示40mg/L氟处理细胞48h,细胞增殖在G0/G1期被阻断,G0/G1期细胞比例显著增加(P<0.01),而S期细胞比例显著减少(P<0.05)。而0.1～20mg/L氟处理细胞对细胞周期未见显著影响(P>0.05,图2b)。

2.3不同浓度氟对PDLSCs成骨分化的影响

由于0.1～10mg/L氟对细胞活力及增殖无显著影响,我们研究了0.1、1及10mg/L这3个氟浓度对PDLSCs成骨分化能力的作用。成骨诱导实验显示,0.1及1mg/L氟明显促进矿化结节的形成(茜素红染色),矿化区面积百分数由对照组的(50.5±4.7)%分别增加到(70.0±4.9)%(P<0.01)及(65.0±5.5)%(P<0.05),但氟浓度为10mg/L时,矿化区面积百分数回落到(54.8±6.3)%(P>0.05);Westernblot实验显示,骨相关蛋白ALP及RUNX2的表达均显著上调。而当氟浓度达到10×10-6mg/L时,PDLSCs的成骨分化水平回到对照组基线水平(P>0.05,图3)。

3、讨论

PDLSCs具有自我更新及多向分化能力,能分化形成牙骨质、牙槽骨和牙周韧带样组织,在维持牙周组织健康中发挥重要作用[8,9]。与其他间充质干细胞相比较,PDLSCs更容易在临床获取,受伦理学限制小;在牙周再生治疗方面具有良好的应用前景[10]。然而,包括牙周组织在内的口腔局部环境经常会处于氟暴露状态;以往研究提示,氟的细胞毒性可以表现为浓度依赖性、时间依赖性,并且对不同类型的细胞毒性并不相同[1];因此,不同浓度氟必然会对PDLSCs的生物学特性及功能产生复杂的影响。本研究中,作者用0.1～40mg/L浓度的氟(NaF溶液)处理PDLSCs来模拟日常生活中牙周组织可能面临的氟暴露状态。

图1氟暴露对PDLSCs细胞形态的影响(倒置显微镜,×100)

图2氟暴露对PDLSCs增殖及细胞周期的影响

图3Westernblot分析氟暴露对PDLSCs成骨分化的影响

结果显示,0.1～10mg/L氟对细胞形态、细胞活力及增殖、克隆形成、细胞周期均无显著影响。而一旦浓度达到20mg/L,细胞活力及增殖明显受到抑制,40mg/L氟完全阻断了细胞集落形成;细胞周期分析显示细胞增殖被阻断于G0/G1期。以上实验结果提示,氟作为药物及防龋制剂应用于临床时,其安全窗口较窄;在大于10mg/L时对PDLSCs产生明显的细胞毒性。由于氟的化学性质非常活泼,多数情况下能作为酶抑制剂,阻断一系列蛋白的合成与分泌,从而影响细胞增殖、凋亡相关的信号通路[1]。但以往也有学者报道,氟暴露对牙周膜细胞增殖存在一种双相的作用;氟在μmol/L浓度水平能促进细胞增殖,而在mmol/L水平抑制细胞增殖(1mmol/L≈20mg/L),提示低浓度的氟能刺激细胞增殖[1,11]。而本研究未观察到上述双相作用,这可能是细胞种类及实验方法上的差异所致。

在研究氟暴露对PDLSCs成骨分化的影响时,我们发现0.1及1mg/L氟,能促进PDLSCs成骨分化,但随着氟浓度增高,当氟浓度达到10mg/L时,其促进成骨作用回到对照组基线水平。碱性磷酸酶(ALP)是造骨细胞早期分化过程中调节钙沉积的关键因子。Li等[11]报道,中低浓度NaF(10和500μmol/L)能显著促进牙周膜细胞ALP的活性。RUNX2是刺激骨形成细胞成骨活动的关键的的转录因子,Yang等[12]等报道低剂量氟(1mg/L和4mg/L)促进小鼠骨髓间充质干细胞ALP的活性及RUNX2的蛋白表达,但当氟浓度达到16mg/L时,对两者均产生抑制作用。

人血清中氟的浓度通常维持在一个较低的水平,即使在高氟区,血清氟浓度也很少能超过0.01～1mg/L的数量级范围[13,14]。本研究通过离体细胞实验证明,氟在该浓度范围对PDLSCs基本无毒性;而0.1及1×10-6mg/L氟对细胞成骨分化具有促进作用。口腔在使用牙科防龋剂及药物后,口腔局部氟浓度可以远高于血清,且发生动态的变化[15],一些牙科修复或种植材料中也被添加了氟的成分[16,17]。牙周组织独特的解剖结构使得PDLSCs处于一个复杂的微环境,牙槽骨改建会使牙体硬组织沉积的氟局部释放,牙周袋内含氟剂的使用会使情况更为复杂。长期、反复高浓度的氟暴露会损伤细胞各项生物学功能,且不同的细胞类型对氟细胞毒性的敏感程度并不相同[1]。因此,临床医师在应用PDLSCs进行牙周再生治疗时,要充分估量氟暴露可能对细胞生物性能的影响;氟对PDLSCs损伤的风险不仅可以来自受体,还可能来自供体;以上问题均有待进一步深入研究。

综上所述,氟暴露会影响PDLSCs的增殖与分化。高浓度氟(20和40mg/L)抑制PDLSCs增殖,而氟浓度较低时(<10mg/L)对PDLSCs增殖无显著影响,并可以促进细胞成骨(0.1和1mg/L)分化。

参考文献：

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邱吟枫,汤颖,沈忆芬,刘超,沈昊,顾永春,于金华.氟暴露对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响[J].口腔医学研究,2020,36(09):866-870.

基金:江苏省口腔疾病研究重点实验室开放课题基金(编号:JSK-LOD-KF-1705);苏州市吴江区卫健委科教兴卫项目(编号:wwk201705).