口腔微生物具有强大的代谢繁殖和渗透能力[1],感染控制不佳会严重影响长期治疗效果[2]。粪肠球菌感染是根管治疗失败的重要原因之一[3],应尽可能降低根管内细菌含量[4]。但根管解剖结构复杂，难以达到较为彻底的细菌控制，影响根管治疗成功率[5]。传统的感染控制方法外，光动力抗菌疗法以其微创简便、高效安全等优点，在口腔等表浅部位的难治性感染治疗方面展现出巨大潜力[6]。光动力抗菌疗法通过激发光敏剂生成具有强氧化性的活性氧簇，破坏微生物蛋白质和脂质等生物大分子[7]。这种广谱作用机制可以有效避免多重耐药菌的产生，并且通过光源的“开关”可以实现治疗的精准时空控制[8]。

在众多光敏剂中，光动力金属有机框架凭借超高的比表面积和灵活的功能位点等优势在抗菌领域展现出良好的实用性[9]。本文拟探究锆卟啉光动力多孔配位金属有机框架(porous coordination network, PCN)对粪肠球菌的抗菌治疗效果，探索利用PCN预防和治疗根管感染的可能性。

一、材料和方法

1 主要试剂与仪器

青霉素-链霉素混合液(Biosharp, 北京);SYTO-9绿色荧光核酸染色剂(Thermo, 美国);杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(Gibco, 美国);脑心浸液肉汤(BHI)(Oxoid, 英国);无水乙醇(Sangon Biotech, 上海)。苯甲酸、二氯氧化锆(ZrOCl2)、meso-四(4-羧基苯基)卟啉[meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine, H2TCPP]、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide, DMF)(Aladdin, 上海);CCK-8试剂盒、Calcein AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(碧云天，上海);多聚甲醛(Servicebio, 武汉)。

分析天平(Mettler Toledo, 德国);微量移液器(Eppendorf, 德国);台式高速离心机(Sigma, 德国);多功能酶标仪(Molecular Devices, 美国);荧光显微镜(Olympus, 日本);扫描电子显微镜(SEM)(Hitachi, 日本);405 nm激光器(LASERWAVE,中国);光功率计(THORLABS,德国)。

2 方法

2.1 纳米粒子制备

将H2TCPP、ZrOCl2、苯甲酸溶液加DMF溶液混合，90℃油浴后离心洗涤干燥制备出PCN纳米粒子，避光备用。材料合成及抗菌作用机制示意图如图1所示。

图1 PCN抗菌机制示意图(本图由Figdraw软件绘制)  

2.2 纳米粒子物象及光动力性能表征

制备纳米粒子扫描及透射电子显微镜样本，分别于扫描及透射电子显微镜下观察，记录形貌表征。使用Zetasizer纳米粒度电位仪(Zetasizer Nano ZS90)测量PCN纳米粒子粒度信息。全波长酶标仪测量PCN纳米粒子吸收光谱和发射光谱。超氧阴离子探针5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-oxide, DMPO),利用电子自旋共振谱仪(electron spin resonance, ESR)检测PCN纳米粒子超氧阴离子生成情况。总活性氧荧光探针2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA),避光条件下配置反应体系，全波长酶标仪测定纳米粒子在405 nm激发光照射下的总活性氧(ROS)生成能力。材料浓度为50 μg/mL,光照参数为50 mW/cm2、1 min。

2.3 纳米粒子体外生物安全性评价

2.3.1人牙龈成纤维细胞的培养

人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, HGFs)来自于北京大学口腔医院中心实验室。HGFs在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基中培养，含5%CO2的37℃孵箱中孵育，胰蛋白酶-EDTA(0.25%,含酚红)进行细胞消化。

2.3.2 CCK-8细胞活力检测

采用CCK-8法评价PCN纳米粒子的细胞毒性。在96孔板中接种HGFs, 每孔100 μL,细胞密度为2×104细胞/孔，每组设置3个复孔。培养24 h后观察到细胞贴壁，换用含不同浓度药物的培养基继续孵育24 h。孵育结束后光毒性检测组使用405 nm激光对细胞进行照射(50 mW/cm2,1 min)。照射结束后，暗毒性与光毒性检测组均换用含10%CCK-8的新鲜培养基，操作过程中避免产生气泡，并设置无细胞的单纯CCK-8组作为空白对照。避光条件下在孵箱内孵育3～4 h后，酶标仪测定体系在450 nm处的光密度值。细胞存活率(%)=(PCN组光密度值-空白组光密度值)/(PBS组光密度值-空白组光密度值)×100%。

2.3.3 活/死细胞染色

对细胞进行活/死细胞染色评价PCN纳米粒子的细胞毒性。在24孔板内接种HGFs, 每孔500 μL,细胞密度为5×104细胞/孔。细胞培养24 h后观察到细胞贴壁，换用分别包含0、25、50 μg/mL浓度纳米粒子的培养基，继续孵育24 h。孵育结束后光毒性检测组使用405 nm激光对细胞进行照射(50 mW/cm2,1 min),暗毒性检测组全程避光处理。每孔加入含钙黄绿素(Calcein AM)/碘化丙啶(PI)的染色工作液300 μL染色5～10 min。染色结束后在荧光显微镜下观察细胞荧光情况。

2.3.4 大鼠口腔安全性验证

北京大学医学部伦理委员会批准(批准号：LA2021473)。采取4周龄雄性SD大鼠，验证50 μg/mL浓度的PCN纳米粒子是否会对大鼠口腔牙龈组织造成损伤。PBS缓冲液为对照组；光照组采取50 mW/cm2、1 min的光照强度。处死后取局部牙龈组织苏木素-伊红(HE)染色。

2.4 纳米粒子体外抗菌性能评价

2.4.1 粪肠球菌的培养

粪肠球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis;ATCC 29212)来自于北京大学口腔医院中心实验室。利用粪肠球菌进行纳米粒子体外抗菌性能评价实验。粪肠球菌在37℃下BHI液体培养基中进行扩增，BHI固体培养基中进行单克隆菌落培养。

2.4.2 梯度稀释计数评价PCN纳米粒子抗菌性能

梯度稀释滴板培养后可获得肉眼可分辨的单克隆菌落，统计菌落数可评价PCN纳米粒子的抗菌性能。挑取粪肠球菌单克隆菌落扩增获得活性良好的粪肠球菌悬液。离心弃培养基，PBS缓冲液重悬。将细菌悬液(终浓度为1×108 CFU/mL)与PCN纳米粒子溶液(终浓度为50 μg/mL)混合，使用405 nm激光进行照射(50 mW/cm2,1 min)。将照射后的抗菌反应体系进行10倍梯度稀释，每梯度依次吸取10 μL滴平板培养。每毫升体系内活菌数=某稀释度下的平均菌落数×稀释倍数×100。同时取200 μL稀释液均匀涂布于圆形平板表面，在37℃下培养至长出可以分辨的单克隆菌落。

2.4.3 活/死细菌染色评价PCN纳米粒子抗菌性能

使用荧光显微镜观察活/死细菌染色直接观察抗菌处理后的细菌活死状态。同样方法对各组细菌进行处理，处理后每组均加入SYTO-9/PI染色液进行染色。染色10 min后离心(9000 r/min, 3 min),可观察到底部细菌沉淀。弃上清液，使用纯水重悬。取5～10 μL液体于载玻片上干燥，使用倒置荧光显微镜油镜观察细菌荧光情况。实验全程避光。

2.4.4 悬浮菌电镜评价PCN纳米粒子抗菌性能

应用上述方法对细菌进行分组处理后，SEM下观察反应后的细菌形态。使用酒精梯度脱水法制备电镜样本。取10 μL左右反应体系液体滴于硅片上充分干燥，固定液浸泡4～6 h。配置30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液。弃固定液，纯水洗涤2遍。洗涤后依次将硅片浸泡于上述梯度乙醇溶液中进行脱水处理，最后于无水乙醇溶液中继续脱水2次，每组脱水时间均为20 min。弃去所有液体，干燥喷金，SEM观察粪肠球菌形态。

3 统计学分析

统计学分析使用IBM SPSS Statistics 27.0软件。当多组间数据进行比较时，首先验证是否符合正态分布。若符合正态分布则再检验方差齐性：方差齐则采用Tukey检验评估组间差异性，方差不齐则采用Hausman检验评估组间差异性。若为非正态分布则采用非参数检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

二、结果

1 PCN纳米粒子合成和物象表征

PCN纳米粒子形貌表征(图2A,2B):SEM观察到合成的PCN纳米粒子形态大小较为均一，颗粒呈椭球型，长径在200～300 nm之间；且纳米粒子在视野内均匀分布，证明其具有良好的分散性。透射电子显微镜(TEM)下(图2C～2E),PCN纳米粒子具有规整一致的形态和清晰边界，分散性良好。PCN纳米粒子Zeta电位为-13.3 mV左右(图2F);吸收光谱如图2G所示，在410 nm左右出现强烈吸收峰，证明PCN纳米粒子在410 nm左右激发光源下能够产生良好的作用效果。PCN纳米粒子在不同激发光源下的发射光谱，其发射谱集中于650～665 nm之间(图2H)。至此，证明了PCN纳米粒子的成功合成并检测其基本表征。

2 PCN纳米粒子光动力性能表征

ESR检测超氧阴离子生成情况(图3A),PCN纳米粒子在光照激发情况下，有明显超氧阴离子峰形生成，而纯捕获剂DMPO、DMPO+PBS和DMPO+PCN无光照组均无明显超氧阴离子生成。总活性氧探针DCFH-DA验证PCN纳米粒子在0～5 min内光照条件下的总活性氧生成能力(图3B～3D),未使用405 nm光源照射时，PCN与对照组均未观察到明显波动，无明显总活性氧簇生成，材料性能较为稳定。光照1 min后，DCFH+PCN组光密度值大幅度上升，证明PCN经光照激发后能够生成大量活性氧簇，其余对照组测得的光密度值均无明显波动趋势，未加DCFH-DA探针的PBS与PCN组呈几乎重合的直线，证明PBS与PCN本底在未加DCFH-DA的状态下不会对光密度值的检测产生干扰。光照5 min后，DCFH+PCN组仍保持活性氧簇较高的生成状态。光照时间达2 min时(图3E),PCN纳米粒子的活性氧簇生成能力基本达到平台期，随后呈缓慢微弱下降趋势。PCN纳米粒子具备在光照后快速、稳定产生大量活性氧簇的能力，提示其具有较大的抗菌潜力。

图2 PCN纳米粒子形貌表征  

图3 PCN纳米粒子光动力性能表征   

3 PCN纳米粒子生物安全性验证

在无光照时，各组材料浓度下HGFs相对成活率都在90%以上，材料无明显暗毒性；光照条件下，材料浓度50 μg/mL及以下时，HGFs相对成活率仍可控制在90%以上(图4A),PCN在50 μg/mL及以下浓度时光毒性较低。荧光显微镜下(图4B)无论是避光孵育处理或是光照处理，绝大多数细胞均发射出强绿色荧光，红色荧光强度极低，纳米粒子50 μg/mL及以下浓度时具有良好的体外生物安全性。动物体内验证纳米粒子安全性，大鼠口腔牙龈组织暴露于纳米粒子环境下未见明显异常(图4C),为PCN纳米粒子的口腔运用提供了安全性保证。

图4 PCN纳米粒子生物安全性验证   

4 PCN纳米粒子抗菌性能验证

单克隆菌落计数(图5A),PCN+光照组无明显菌落长出，而PBS+无光照组、PBS+光照组和PCN+无光照组细菌生长旺盛，具有显著统计学差异(P<0.01)。PCN+光照组培养皿内未见明显菌落生成，证明PCN纳米粒子具有良好的光动力抗菌能力(图5B)。

PCN+光照组细菌显示为强红色，绝大多数细菌细胞膜都已受损，PI进入细胞核内与核酸产生结合，处于死亡状态；而PBS+无光照组、PBS+光照组和PCN+无光照组均显示为强绿色，红色荧光程度弱(图5C),表明大部分细菌未被杀灭，PCN纳米粒子具有良好的光动力抗菌效果。同样，PBS+无光照组、PBS+光照组和PCN+无光照组细菌形态完整，边缘清晰，未见明显细胞壁穿孔皱缩等，而PCN+光照组如黄色箭头所示，细菌菌体塌陷，细胞质外溢，边缘不清晰(图5D),证明经PCN光照处理后的细菌已处于失活状态。

图5 PCN纳米粒子抗菌性能验证  

三、讨论

根管内感染是导致根管治疗失败的重要原因之一，其主要致病菌粪肠球菌可以造成牙本质的顽固性感染[10]。唾液中浮游的粪肠球菌容易侵入开放的根管系统，并分泌胶原蛋白黏附素，特异性地结合牙本质的主要有机成分I型胶原蛋白，从而牢固定植于根管系统内[11]。粪肠球菌能够分泌溶细胞素和明胶酶等多种毒力因子，并通过与其他菌群的协同作用增强自身的环境适应性和耐药性[12]。除此之外，在全身免疫力低下时，局部病灶内的粪肠球菌可以突破宿主屏障，通过血液循环分布于全身，引起远隔部位感染[11]。

目前，根管治疗感染控制方法存在一定局限性[13]。临床上常用的双氧水、次氯酸钠和氯己定等药物较难彻底清除粪肠球菌感染，并且可能伴随较大的根尖周刺激等副作用。而使用抗生素控制局部粪肠球菌感染时，局部病灶内往往仅可维持亚致死性浓度，长期使用会产生多药耐药菌。原因在于抗生素一般利用的是“钥匙孔”机制，通过靶向致病菌的某一特殊成分精准阻碍微生物代谢[14],长期筛选后对该机制具有抗性的致病菌将繁殖壮大成为主流，后续的抗生素治疗效果将被严重削弱。

当常规抗菌治疗效果有限时，光动力抗菌疗法以其安全高效、广谱微创等优点被重视[7]。光动力抗菌疗法能够对细菌的普遍结构和代谢通路造成损伤，无需特定的细菌靶标，能够有效避免抗生素的筛选作用。此外，光敏剂的给药与光照激发间通常间隔较短，并且使用的光敏剂一般暗毒性较低，因此细菌无需参与针对光敏剂的适应性生存筛选。基于光动力治疗的诸多优势，1990年Kennedy教授等历史性地将5-氨基酮戊酸光动力疗法运用于治疗皮肤基底细胞癌[7]。此后光动力疗法的应用更加广阔，尤其是现在细菌耐药问题日益凸显，有望成为缓解细菌耐药状况的手段之一。

在各类光动力抗菌纳米材料中，光动力金属有机框架以易于活性氧扩散的多孔结构、预防自猝灭的有序框架、良好的修饰负载能力以及优异的生物相容性等优点，成为光动力抗菌领域的首选之一[15]。PCN系列为立方多面体纳米孔笼，在空间上形成的孔笼-孔道拓扑结构具有超高比表面积，大量的功能性金属位点和有机基团易于获得表面官能化，大孔径特点允许负载多种客体分子，制备成本低、流程简易、长期稳定性好。因此，利用PCN进行口腔难治性粪肠球菌感染治疗具有良好的临床前景[16]。

综上所述，粪肠球菌感染是导致口腔根管治疗失败乃至全身系统性感染的重要致病菌之一，光动力金属有机框架PCN凭借优良的光动力抗菌效果、灵活可调的框架结构和简易可靠的制备流程等优势，成为光动力抗粪肠球菌感染的良好选择。本实验验证了PCN优异的生物相容性和抗菌能力，为PCN治疗口腔感染提供了重要的理论参考和实验依据。在未来研究阶段，可以进一步探索PCN对粪肠球菌生物膜的作用效果和增强PCN抗菌能力的修饰方法，推动光动力金属有机框架的临床运用。

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基金资助:国家自然科学基金项目(编号51972003);

文章来源:董绘华,张栌丹,王宇光.光动力金属有机框架PCN对粪肠球菌杀灭效果的体外研究[J].临床口腔医学杂志,2023,39(12):707-711.