首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 口腔科论文 > 口腔矫形学论文 > GsMTx4对大鼠牙齿移动过程中痛觉的抑制作用

GsMTx4对大鼠牙齿移动过程中痛觉的抑制作用

2024-11-22 108 上传者：管理员

摘要：目的通过旷场实验、免疫组化染色，研究GsMTx4在牙齿移动过程中对大鼠痛觉的抑制作用。方法选取58只5～6周雄性SD大鼠，并构建右上颌牙齿移动模型。随机将大鼠分为A组(对照组)、B组(GsMTx4组)两组，另按加力时间4 h和1、3、5、7 d分为5个亚组，以A组大鼠左上颌作为C组(空白对照组)。A、B两组大鼠分别局部注射生理盐水、GsMTx4。通过旷场实验评价大鼠的疼痛程度，免疫组化染色观察牙周组织中神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)的表达情况。结果 4 h、1 d、3 d时，B组大鼠在旷场中5 min内的总路程较A组更高(P<0.05)。在4 h、1 d时，B组大鼠中心区域停留时间百分比较A组高(P<0.05)。A、B两组中NGF、CGRP的表达在1、3、5、7 d时高于C组(P<0.05)。B组NGF、CGRP表达在4 h、1 d、3 d的均低于A组(P<0.05)。结论 GsMTx4在牙齿移动过程中能抑制NGF、CGRP的表达，并缓解牙齿移动时产生的疼痛。

关键词：
CGRP
GsMTx4
正畸
神经生长因子
降钙素基因相关肽
加入收藏

疼痛是正畸治疗过程常见的不良反应，对正畸治疗的患者而言，这种疼痛会影响患者的咀嚼和言语功能，降低患者的生活质量[1]。正畸疼痛的发生率约为90%,少部分患者因无法忍受疼痛而选择提前终止正畸治疗，也有部分存在错牙合畸形的患者因害怕疼痛拒绝接受正畸治疗[2]。目前有多种缓解正畸牙齿移动的方法，包括药物治疗、微波震动治疗、低强度激光治疗等，然而现有的治疗方法存在不良反应和效果不佳等问题[3]。因此，控制正畸治疗疼痛仍是临床治疗中需要解决的难题。

GsMTx4为机械敏感通道的抑制剂，其中D型GsMTx4可抑制Piezo2产生电流，且这种抑制作用具有剂量依赖性及可逆性[4]。Piezo2为机械离子门控通道的一种，可以将机械刺激转导为电信号，从而使生物可以感受与触觉等相关的机械刺激，并介导机械刺激引起的异常性疼痛[5-6]。近年来有研究发现，Piezo2介导在胃肠道疾病、三叉神经损伤等疾病中疼痛的产生，应用GsMTx4可以减弱发病时的疼痛[7-8]。该离子通道广泛存在于牙周组织的成纤维细胞及靠近固有牙槽骨的成骨细胞中[9],但关于该离子通道与正畸牙移动疼痛的关系，目前尚未明确。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是神经生长和修复过程中一种重要的蛋白质，参与炎症性疼痛的调节，并可诱导局部痛觉过敏的发生[10];降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是一种神经元分泌的神经肽，广泛地分布于中枢及外周神经系统，在局部组织中释放可增强疼痛[11]。本实验通过建立大鼠牙齿移动模型，使用GsMTx4抑制牙周组织中的Piezo2通道，并观察大鼠在旷场实验中的行为变化以及牙周组织中NGF、CGRP的表达变化，探究GsMTx4在正畸牙移动疼痛的作用，为临床工作中缓解正畸疼痛提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

GsMTx4(MCE,中国),乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA),兔抗NGF多克隆抗体(ImmunoWay, 中国),兔抗CGRP多克隆抗体(Bioss, 中国),抗兔IgG(博士德，中国),DAB显色试剂盒(博士德，中国),甲醛固定液，镍钛拉簧，酸蚀剂，粘接剂，流体树脂，正畸结扎丝，旷场实验箱。

1.2 方法

1.2.1 实验对象及分组

选取6～8周的雄性SD大鼠58只(辽宁长生),体重(200±20)g。购置后分笼饲养，适应性喂养1周。随机将大鼠分为A组(对照组)、B组(GsMTx4组)两组，并按4 h、1 d、3 d、5 d、7 d各加力时间点分成5个亚组，除7 d亚组外每个亚组5只，7 d亚组9只，并以A组左上颌作为C组(空白对照组)。所有大鼠均于右上颌加装加力装置，构建正畸牙齿移动模型，左上颌不做处置。A组大鼠在实验开始时局部注射生理盐水，注射部位为受力的右上颌第一磨牙颊腭侧、上颌切牙唇腭侧，给药剂量为每侧50 μL,B组大鼠于相同位置注射等量浓度为48 μmol/L的GsMTx4。本研究已获得哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2.2 动物模型建立

实验开始前大鼠禁食12 h, 腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，将大鼠固定取仰卧位。以大鼠上颌两切牙为支抗，镍钛拉簧为施力装置，加载力值为0.5 N,牵拉右上颌第一磨牙向近中移动。用结扎丝穿过大鼠右上颌第一、二磨牙邻间隙，并与镍钛拉簧拴扎。在上颌中切牙颈部做0.2 mm深固位沟，将切牙与镍钛拉簧拴扎，酸蚀粘接树脂包裹结扎丝。磨短下颌切牙。观察大鼠，待彻底苏醒后放回鼠笼。每日检查施力装置情况，并将脱落的装置重新固定。

1.2.3 旷场实验

旷场为100 cm×100 cm×40 cm的亚克力箱。实验开始前所有大鼠在实验场地适应15 min。选取A、B两组7 d亚组大鼠进行旷场实验。大鼠放置于旷场中的同一位置，分别记录每只大鼠实验加力后4 h、1 d、3 d及7 d的活动轨迹。每只大鼠实验结束后均对旷场进行清洁。使用软件ANY-maze 7.20分析大鼠5 min内的总路程，中心区域停留时间与实验总时间的比值(中心停留时间百分比),用于评估大鼠的疼痛程度。

1.2.4 标本取材与处理

按照实验时间点处死A、B两组大鼠，取材大鼠上颌骨骨块，甲醛固定24 h, 10%EDTA脱钙12周，自动脱水机脱水，浸蜡包埋。沿第一磨牙牙根长轴方向连续切片，厚度4 μm。

1.2.5 免疫组化染色

石蜡切片烤片机60 ℃烤60 min, 脱蜡至水。抗原修复，孵育，分别加入兔抗NGF多克隆抗体(1∶100稀释),兔抗CGRP多克隆抗体(1∶100稀释),湿盒4 ℃过夜。孵育二抗，DBA显色，苏木素染液核染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。应用Image Pro Plus 6.0软件进行半定量分析，每张切片在高倍镜下( ×200)随机选择上颌第一磨牙牙周组织3个不重叠视野，检测各组平均光密度值(mean optical density, MOD),取平均值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。旷场实验结果不符合正态分布，采用Mann-WhitneyU检验分析组间差异。免疫组化染色结果符合正态分布及方差齐检验，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较组间差异，组间两两比较选用Bonferroni检验。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 旷场实验结果

在4 h、1 d、3 d时，B组大鼠在旷场中5 min内的总路程值显著高于A组(P<0.05)。在4 h、1 d时，B组大鼠中心区域停留时间百分比值显著高于A组(P<0.05)。在旷场实验中，A、B两组大鼠在旷场中5 min内的总路程变化趋势为先减小后升高，在3 d降至最低，在5、7 d增加并趋向平稳，但低于4 h时的水平。中心区域停留时间百分比变化趋势为先减小后升高，大鼠在1 d降至最低，在3 d开始缓慢增加并趋向平稳(图1)。

图1旷场实验结果

2.2 NGF和CGRP免疫组化染色结果

NGF在C组牙周组织中有少量表达。A、B两组NGF表达水平显著高于C组(P<0.05);B组在4 h、1 d、3 d时表达显著低于A组(P<0.05)。牙周组织中A、B两组NGF表达趋势相近，实验初期呈增加趋势，在3 d时最高，在5、7 d时减小(表1、图2)。

表1 NGF在牙周组织中的表达

图2牙齿移动3 d后NGF的表达( ×200)

表2 CGRP在牙周组织中的表达

图3牙齿移动3 d后CGRP的表达( ×200)

3、讨论

Piezo2为机械敏感通道，对感受部分机械刺激至关重要，可以将机械刺激转导为电信号，并介导机械刺激引起的疼痛[6,12]。有研究观察到Piezo2在人及小鼠的牙周膜中表达[9],施加正畸力后6 d内Piezo2表达缓慢增加，9～12 d时达到峰值[13]。而D型GsMTx4可以抑制Piezo2通道的开放[4],从而影响Piezo2介导的痛觉[8]。

评估大鼠疼痛的方法包括旷场实验、高架十字迷宫实验、表情分析、颜面整饰分析等。其中旷场实验利用啮齿动物的趋触性及探索欲对其行为进行观测，近年来被广泛应用于评估大鼠受到的持续性疼痛[14]。在旷场实验中，感受到疼痛的大鼠压力增加，探索欲也随之弱化，在旷场中心区域停留的时间及移动总路程将会减少。因此，可以通过测试大鼠进入旷场中心的停留时间及在旷场中的移动距离，评估大鼠在牙齿受力后的疼痛程度。在实验开始后的4 h至3 d, A、B两组大鼠在旷场中的活动量逐渐减少，这与临床中患者受到正畸力后痛觉感受变化相符；B组大鼠在旷场中活动量更高，表明相比A组大鼠，B组大鼠感受的疼痛程度较低。该结果证实了局部注射GsMTx4可以降低大鼠感受的疼痛。

NGF与痛觉密切相关，应用NGF抗体可以缓解牙齿移动引起的疼痛，并可以减少机械性痛觉过敏的发生[15]。痛觉过敏为生物体痛觉感受的阈值降低和对疼痛反应增强[16]。另一方面，NGF可以通过调控CGRP的表达调节颌面部疼痛，而CGRP又可增强NGF引起的颌面部疼痛[17]。在牙周组织中分布有CGRP阳性的神经纤维，可分泌CGRP,CGRP参与中枢神经及外周神经系统的敏化，产生机械性痛觉过敏[18];有实验在局部组织中注射微量CGRP即可引发小鼠局部的疼痛[19]。A、B两组大鼠牙周组织中NGF、CGRP的表达呈先增后降的趋势，4 h至3 d时NGF与CGRP的表达量逐渐增加至峰值，与此同时大鼠中心区域停留的时间及移动总路程逐渐减小，这与患者在受到正畸力后感受到的疼痛变化相符，NGF、CGRP参与调控牙齿移动过程中的疼痛。此外，Prato等[20]、Nencini等[21]分别从细胞水平及动物水平证实的Piezo2与NGF之间存在密切关系，在敲除Piezo2后，可以抑制NGF诱导的对机械刺激的敏感性；也有研究发现编码Piezo2与NGF受体的基因在伤害感受器中共表达，Piezo2与NGF协同诱导下游因子，导致疼痛和痛觉过敏[22]。在一项关于膀胱黏膜的研究中发现，CGRP阳性感觉纤维上有Piezo2表达，而Piezo2表达升高与膀胱炎中机械性疼痛密切相关[23],推测Piezo2可能调节感觉神经中CGRP的释放，并引发疼痛。本实验中，B组大鼠牙周组织中NGF、CGRP的表达量较A组少，提示GsMTx4 对Piezo2有抑制作用，从而抑制牙周组织中NGF、CGRP的表达。

综上所述，本实验通过建立大鼠牙齿移动模型，对Piezo2抑制剂GsMTx4使大鼠的痛觉减弱，并对NGF、CGRP的表达减少进行了探讨。我们初步验证GsMTx4对正畸疼痛的抑制作用，并推测Piezo2参与正畸疼痛的产生。然而，目前对于Piezo2参与正畸疼痛的机制的研究较少，随着对该机制的深入研究，未来Piezo2有望成为缓解正畸疼痛的新治疗靶点，研发针对Piezo2的药物，从而在不久的将来为正畸临床诊疗中疼痛的控制提供行之有效的新方法。

参考文献:

[13] 康婷.机械敏感性离子通道Piezo在正畸牙周组织中表达和功能的研究[D].西安:第四军医大学,2014.

文章来源:王若飞,邵丽鑫,刘晓彤,等.GsMTx4对大鼠牙齿移动过程中痛觉的抑制作用[J].口腔医学,2024,44(11):815-819.