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荧光偏振法在布鲁菌病抗体检测中的应用
摘要：目的 荧光偏振法应用于人体血清布鲁菌病(简称“布病”)抗体检测，分析其在布病诊断中的应用价值，为布病实验室检测提供科学依据。方法 收集贵州省2021年布病重点监测人群的血清245份，同时应用荧光偏振法(fluorescence polarisation method, FPA)、虎红平板凝集试验(rose bengal test, RBT)、血清凝集试验(serum agglutination test, SAT)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)进行检测，分析4种检测方法结果间的一致性、敏感性和特异性。结果 FPA与RBT、SAT、ELISA的Kappa值分别为0.852、0.845、0.778,FPA与传统RBT、SAT的Kappa值均>0.750,即FPA与其他3种诊断方法比较，有很高的一致性。ELISA与RBT、SAT、FPA的Kappa值分别为0.779、0.804、0.778,ELISA与其他3种方法的Kappa值为0.610～0.800,即ELISA与其他3种诊断方法比较，有较好的一致性。与确诊试验SAT比较，RBT的敏感性和特异性均高。FPA、ELISA与SAT比较敏感性和特异性也较高，敏感性均为86.2%,但FPA的特异性(98.4%)高于ELISA的特异性(94.3%)。结论 与SAT进行比较，FPA和ELISA敏感性好、特异性强、一致率高、Kappa值较高；RBT一致性较好、敏感性高、特异性一般、易出现假阳性。通过比较和分析4种布病血清抗体的实验室检测方法，荧光偏振法作为一种新技术，有较高的灵敏度和特异度，对布病的防治有重要意义。
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布鲁菌病是由革兰阴性布鲁菌属细菌侵入机体引起的变态反应性疾病，属人兽共患传染病[1]。目前有170多个国家存在布鲁菌病的流行[2,3],我国受布病威胁的人口数约3.5亿，现有患者约50万例。病例临床表现有发热、多汗、乏力、关节痛等，同时还会导致其生殖系统症状，若转入慢性期则很难治愈[4]。2010年贵州省大力发展养殖业，引进大量牲畜(以牛、羊为主),羊的饲养主要以当地农户为基础，由政府提供技术支撑[5]。贵州省于2010年首次从山羊血液分离到羊种布鲁菌[6],到2015年贵州省布病疫情已覆盖贵阳、黔南、黔东南、铜仁、遵义、黔西南、六盘水、安顺和毕节9个市/州及贵安新区，仅部分县未报道过布病疫情[7],防控形势严峻。
人间布病的诊断主要是依靠临床表现、流行病史和实验室检测。实验室检测方法中，病原菌分离是诊断布鲁菌病的“金标准”[8,9,10],但分离周期较长，生物安全级别要求高，不利于基层实验室推广应用。故血清学检测方法是目前布鲁菌诊断的主要手段，其检测方法主要有虎红平板凝集试验(RBT)、血清凝集试验(SAT)、胶体金免疫层析实验(gold immunochromatography assay, GICA)、补体结合试验(complement fixation test, CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等试验[11,12,13,14]。自1897年Weight建立了试管凝集反应后，布病血清学检测技术得到快速发展和改进，是目前布病抗体检测最常用的确诊方法[15,16,17,18]。FPA作为监测、筛查传染病的新方法，有操作简单、反应迅速、结果准确、易于自动化[19,20,21]等特点。本研究采用荧光偏振试验、虎红平板凝集试验、血清凝集试验和酶联免疫吸附试验检测人体布鲁菌病血清抗体，对4种方法进行比较，分析试验结果的一致性、敏感性和特异性，为实验室有效开展人间布鲁菌病的诊断方法提供一定的参考依据。
1、材料与方法
1.1 样本
2021年贵州省布病监测点采集的重点人群血清样本，共245份。本研究经过医学伦理委员会审核。
1.2 试剂
布病虎红平板凝集抗原(中国疾控中心生产，批号：2020.10);布病试管凝集抗原(中国疾控中心生产，批号：2020.06);人布病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒(黑龙江省平河生物技术研究所生产，批号：2021.11.06);人布病荧光偏振测定法抗体检测试剂盒(黑龙江省平河生物技术研究所生产，批号：2021.11.06);阳性对照血清(中国疾控中心生产，批号：2019.12)。
1.3 主要仪器
荧光偏振检测仪(德国FLUPO,批号：200070022;振荡器(美国VORTEX,批号：YN-H06-1085);37℃恒温水浴箱(BINDER-Hotline International, 批号：H1408327);酶标仪(thermo-MULTISKAN SkyHigh, 批号：1550-800512)。
1.4 布病虎红平板凝集试验
严格按照《布鲁氏菌病诊断》(WS 269—2019)规定的标准操作，出现肉眼可见凝集现象判定为阳性(+),无凝集现象判定为阴性(-)。
1.5 布病试管凝集实验
严格按照《布鲁氏菌病诊断》(WS 269—2019)规定的标准操作，判断产生50%凝集血清的最大稀释度为受检血清效价，人布鲁菌病待检血清的凝集价在1∶100及以上者判定为阳性(+),1∶50判定为可疑样本。
1.6 ELISA检测
按照说明书要求进行操作，使用酶标仪在450nm处测定样品光密度(optical density, OD)值[21]。同时设置阴性、弱阳性、强阳性以及临界值做对照。结果计算：计算C++的平均OD值，C++被认为阳性百分值为100%,其他对照样品的阳性百分值按照下列公式计算：阳性百分值P%=被检血清OD值×100/C+平均OD值，阳性百分值(P%)>24%为阳性结果。
1.7 FPA检测
按照说明书进行操作，样品检测值<72mP为阴性，表示无抗布鲁菌抗体；72～93mP为弱阳性；>93mP为阳性，表示有抗布鲁菌抗体[22]。
1.8 评价指标的选择
在评价不同试验检测效果时，利用医学统计学方法将对照试验与参比实验的检测结果进行比较，计算各检测方法间的一致率、Kappa值、敏感性、特异性等指标，用来比较不同诊断试验的价值。一致率是检测方法的相关程度；Kappa值用于评价一致性的测量值，一般Kappa值≥0.750说明两种方法诊断结果一致性较好，0.400≤Kappa值<0.750说明一致性一般，Kappa值<0.400说明一致性不够理想。见表1。
表1 对照试验与参比实验形成的四格表
1.9 统计学分析
采用Excel 2019表建立数据文件，计算敏感性、特异性以评价各试验技术，采用Kappa值和一致率对各试验间的一致性进行比较，并应用SPSS 19.0软件进行χ2检验，分析各方法间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。
2、结 果
本试验主要是FPA、ELISA与传统血清学检测技术中最为常用的RBT、SAT进行比较，将FPA和ELISA分别作为参比实验与其他3种试验进行一致性比较，结果显示：初筛试验RBT和确诊试验SAT都是阴性结果时，FPA诊断结果中有2个样本检测出阳性结果、ELISA结果中有7个阳性结果，说明FPA和ELISA的灵敏度均高；当RBT为阴性结果时，SAT有7个样本检测出阳性结果，FPA和ELISA也出现了5个阳性结果；当RBT检测阳性时，SAT均为阳性结果，但FPA和ELISA出现了多个检测结果不一致的情况。
2.1 FPA与RBT、SAT、ELISA检测结果的一致性比较
FPA与RBT、SAT、ELISA比较得到的Kappa值分别为0.852、0.845、0.778,FPA与传统RBT、SAT的Kappa值均>0.750,即FPA与其他3种诊断方法比较，有很高的一致性。见表2。
表2 FPA与RBT、SAT、ELISA检测结果的一致性比较(例)
2.2 ELISA与RBT、SAT、FPA检测结果的一致性比较
ELISA与RBT、SAT、FPA的Kappa值分别为0.779、0.804、0.778,ELISA与其他3种方法的Kappa值为0.610～0.800,说明ELISA与其他3种方法诊断结果高度符合，即ELISA与其他3种诊断方法比较，有较好的一致性。见表3。
表3 ELISA与RBT、SAT、FPA检测结果的一致性比较(例)
2.3 SAT与RBT、ELISA、FPA检测结果的敏感性和特异性比较
RBT与确诊试验SAT比较敏感性和特异性均高。FPA、ELISA与SAT比较敏感性和特异性也较高，敏感性均为86.2%,但FPA的特异性(98.4%)高于ELISA的特异性(94.3%)。见表4。
表4 SAT与RBT、ELISA、FPA检测结果的敏感性和特异性比较(例)
2.4 不同检测方法χ2检验比较
用SPSS 19.0软件分析出FPA、RBT、SAT、ELISA各方法中两两检测方法结果差异均有统计学意义[FPA与RBT(χ2=178.673,P<0.001);FPA与SAT(χ2=177.585,P<0.001);FPA与ELISA(χ2=148.375,P<0.001);SAT与RBT(χ2=218.519,P<0.001);SAT与ELISA(χ2=159.491,P<0.001);ELISA与RBT(χ2=148.644,P<0.001)]。
3、讨 论
布鲁菌病病例如不能得到及时治疗，极易导致其家庭因病致贫。由于布鲁菌病临床症状不典型，因此实验室检测对布鲁菌病的诊断有重要意义。贵州省于2010年报告了首例布病病例，之后报告病例逐年增多。2017—2021年贵州省布病年发病率分别为0.29/10万、0.13/10万、0.07/10万、0.14/10万、0.23/10万。共涉及9个市/州60个县区，其中遵义市63例、黔东南州42例、铜仁市40例、毕节市37例、黔西南州29例、六盘水市27例、贵阳市13例、黔南州9例、安顺市2例。人群分布主要为农民、牧民、待业及学生，发病例数分别为农民188例、牧民32例、家务及待业20例、学生14例。布病防控工作任重而道远。
通过对4种布鲁菌病血清学诊断方法的比较可以得出，RBT作为经典的布鲁菌病抗体检测初筛实验，具备检测时间短、试剂耗材要求低的特点。但RBT会出现假阳性结果，可能是因为一些非特异性因素引起的虎红颗粒自凝；SAT检测布鲁菌病抗体，需24h的反应时间，同时进行大样本检测时，耗时较长，结果观察受主观因素较大，对实验人员要求较高，但鉴于其结果准确，一直作为布鲁菌病抗体检测的确诊实验；荧光偏振法作为一种新型的布病血清抗体检测技术，有较高的敏感性和特异性，且操作简单、检测时间较短，分析结果应用荧光偏振仪检测，不依赖人为主观判断，结果稳定准确，且仪器小巧易携带，可用于野外大样本的检疫和筛查工作。但有可能漏检。因此，FPA结合ELISA实验结果，可在不影响检测时间(3～4h)前提下，保证结果的准确性。
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基金资助:贵州省传染病人才培养基地建设项目子项目(RCJD2102);
文章来源:王月,张悦,谭勤琴等.荧光偏振法在布鲁菌病抗体检测中的应用[J].医学动物防制,2024,40(01):101-104.
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2023-12-13
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