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枯草芽孢杆菌富硒诱变实践探究

2020-11-28 295 上传者：管理员

摘要：从黑龙江省齐齐哈尔市采集土样，利用常规方法分离到枯草芽孢杆菌，并且采用紫外线诱变的方式对分离到的枯草芽孢杆菌进行富硒诱变，并且优化了富硒条件。结果共分离到3株枯草芽孢杆菌，紫外线诱变后有1株（HLJ-1）具有良好的富硒能力，在培养8h时，添加20μg/mL亚硒酸钠，34℃培养12h，枯草芽孢杆菌的有机硒含量为14.64μg/mL，富硒率为73.2%。

关键词：
富硒
微量元素
有机硒
枯草芽孢杆菌
紫外线诱变
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硒是参与动物、植物机体各种生化反应必不可少的微量元素，而我国有70%以上的地区缺硒[1]，造成了植物、籽实中硒含量不足，这就需要在食品中及动物饲料中添加硒制剂。现在添加方式主要是无机硒（亚硒酸钠）和有机硒，亚硒酸钠吸收利用效果不好，并且有很大的毒性，存在安全隐患，所以开展富硒微生物的研究就显得尤为重要。枯草芽孢杆菌生物量大，能够提高机体免疫力[2]，减少相关疾病的发生，并且能够抑制有害微生物，是非常受欢迎的有益微生物品种。本研究把分离到的枯草芽孢杆菌进行紫外线诱变使之具有富硒能力，并且优化了发酵方式，给动物、植物补充有机硒提供了新的思路。

1、材料与方法

1.1材料与主要仪器

土壤样本采集于齐齐哈尔市龙沙公园等枯树叶及枯草较多的低洼地，距地面10cm的腐殖土，取土壤100g，把采得的土壤放入自封袋中带回实验室-20℃保存。

LB琼脂培养基，LB培养基，生理生化鉴定培养基，亚硒酸钠；革兰氏染色试剂盒，细菌基因组提取试剂盒。高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，台式离心机，光学显微镜，pH计，分光光度计，磁力搅拌器，15W紫外线灯等。

1.2枯草芽孢杆菌的分离鉴定

取1.0g土样，放入烧杯中，加入100mL蒸馏水煮沸10min，冷却后取50μL涂布于LB琼脂平板中，48h后挑取形态类似枯草芽孢杆菌的菌落继续分离纯化。

分离到的疑似枯草芽孢杆菌参考《常见细菌系统鉴定手册》[3]的方法进行生化鉴定；采用细菌基因组提取试剂盒所标明的方法提取细菌总DNA。采用16SrDNA通用引物进行PCR和测序，正向引物：5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGATT-3'。产物送宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.3枯草芽孢杆菌紫外线诱变及富硒试验

将培养48h的枯草芽孢杆菌菌落用无菌生理盐水洗下，装入平皿中，用磁力搅拌器搅拌均匀，调整细菌数为108mL-1。取5mL菌液放入直径7cm的无菌培养皿中，在15W紫外线灯下30cm处照射，每30s取一次样，稀释到10-4涂LB琼脂平板，37℃黑暗培养48h，未照射的做空白对照。并且根据诱变结果，调整紫外线照射时间，将样品稀释到10-5，取50μL涂布于含有亚硒酸钠50μL/mL的LB琼脂平板，根据菌落大小和颜色判断诱变成功与否。

取诱变成功的菌株，3%接种于含硒10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的装有50mLLB培养基的500mL三角瓶中，在180r/min、34℃恒温培养12h后，测量有机硒的含量。选取对枯草芽孢杆菌富硒能力影响较大的亚硒酸钠浓度、培养温度和加硒时间3个因素做正交试验，优化富硒条件。

硒含量的测定采用《食品安全国家标准食品中硒的测定》（GB500993-2010）中的方法———荧光法测定食品中硒的方法。

2、结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌的分离鉴定

分离到3株疑似枯草芽孢杆菌菌株，菌落呈灰白色、不透明、表面粗糙，菌落呈圆形。革兰氏染色阳性。

经过一系列生理生化鉴定，结果见表1。这3株疑似菌株的生理生化反应均与枯草芽孢杆菌一致，初步鉴定为芽孢杆菌属。

表1HLJ-1、HLJ-2、HLJ-3菌株的生理生化测试结果

注：“+”表示阳性或能利用；“-”表示阴性或不能利用。

分子生物学鉴定，提取菌株的16SrDNA并扩增序列，与GenBank中登记的16SrDNA序列进行同源性比较，结果表明，分离到的3株菌株（命名为HLJ-1、HLJ-2、HLJ-3）的l6SrDNA与枯草芽孢杆菌的16SrDNA同源性达到99.15%，确定分离到的菌株为枯草芽孢杆菌。

2.2枯草芽孢杆菌紫外线诱变及富硒试验

将紫外线照射后的菌株培养48h，进行菌落计数。根据平板上菌落数，计算出致死率，即致死率=

致死率结果见图1，随着时间的增加，致死率逐渐增大，150s时几乎全部死亡，120s时的致死率为88.7%，这时突变率最高，所以紫外线诱变时间定为120s。在紫外线120s照射诱变下，通过多次亚硒酸钠LB琼脂平板培养，发现HLJ-2紫外线诱变后菌落大，颜色浅，用来做富硒的目的菌株。

图1不同照射时间菌体的致死率

通过观察培养液的颜色，发现随着硒浓度的增加，菌液逐渐变红并且加深，10μg/mL没有变红，20μg/mL、30μg/mL不明显，50μg/mL最红，所以认为可能的适合硒浓度为15～25μg/mL。

选取加硒质量浓度、加硒时间和培养温度进行3因素3水平正交试验，因素水平见表2。

表2正交试验因素及水平

表3正交试验结果与分析

由表3可知，3个因子对菌体富硒量影响大小依次为C>B>A，即加硒浓度>加硒温度>培养时间；最佳培养条件为A2B1C2，即选用培养至8h时加20μg/mL硒，在34℃培养12h。重复试验，菌体硒含量为14.64μg/mL，富硒率为73.2%。

3、讨论

大多数富硒微生物多采用已经应用的菌株，本课题从我国北区分离到3株枯草芽孢杆菌，通过紫外线诱变及耐硒胁迫试验发现其中1株能耐受较高浓度的亚硒酸钠，通过培养发现，该菌在34℃具有较好的表现，低于大多数文献中的37℃，可能是本研究采样为在北方寒区环境，菌株长期处于低温状态生长，其最适合的温度相应变低。在添加亚硒酸钠浓度低时，枯草芽孢杆菌中有机硒的含量与培养液中的亚硒酸钠添加量正相关，但是随着浓度的增高，亚硒酸钠对微生物的毒性增大，抑制枯草芽孢杆菌的生长，反而有机硒产量减少。在亚硒酸钠过多的时候，枯草芽孢杆菌不能全部将其转化为有机硒，而是把部分转化为单质硒（呈红色），所以高浓度的亚硒酸钠培养表现出红色。本实验通过正交试验得出，HLJ-2在培养8h后一次性添加20μg/mL的亚硒酸钠，在34℃培养12h，有机硒含量为14.64μg/mL，此方法经济可行，为畜牧业及种植业添加有机硒提供新方法。

参考文献：

[1]龚晓钟,欧阳政,蔡端仁.富硒茶叶和富硒大蒜中硒的有机形态[J].天然产物研究与开发,1996,8(1):59-62.

[2]胡群宝,郭宝江.螺旋藻硒多糖对小鼠免疫功能的影响[J].中国海洋药物,2001,20(5):18-20.

[3]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:43-65.

孟维珊,崔毅,白长胜.枯草芽孢杆菌的分离及富硒试验[J].现代畜牧科技,2020(12):11-12+16.