蛋白酶是一类能够将蛋白质降解成小肽和氨基酸的水解酶,在饲料业、食品业、制药业、皮革加工行业以及洗涤品行业广泛应用[1,2]。作为三大工业用酶之一的蛋白酶,在全球酶制剂市场份额中占60%[3,4,5]。自然界中的蛋白酶主要来源于动物、植物和微生物,与前两者相比,来源于微生物的蛋白酶由于其能够被大规模发酵制备、易于纯化等特点而更受关注。来源于微生物的蛋白酶占全球商品蛋白酶的三分之二,与植物和动物源蛋白酶相比,微生物源蛋白酶更能满足工业生产所需[6,7,8]。

根据酶最适反应pH,微生物源蛋白酶可被分为酸性(pH3.8～5.6)、中性(pH为5～8)和碱性(pH9～11)三类[4]。能够生产中性和碱性蛋白酶的微生物种类较多,如芽孢杆菌、假单胞菌、李斯特菌等细菌,青霉、毛霉和曲霉等真菌以及链霉菌、拟诺卡氏菌等放线菌[1]。其中,芽孢杆菌用途最广,且最适合用于发酵生产蛋白酶类的饲料添加剂或者生物饲料。有研究表明,芽孢杆菌所产的蛋白酶在处理动物皮毛方面能够表现出非常好的性能,如水解蛋白作用、弹性纤维溶解作用以及角蛋白的分解作用等[9,10];芽孢杆菌所产的碱性蛋白酶除了能够发挥降解大分子蛋白质的作用以外,还能够通过细胞溶解作用杀灭动物肠道中的大肠杆菌、单增李斯特菌、鼠疫杆菌等病原菌[11]。与其他产酶微生物相比,芽孢杆菌还具有非致病性、生长速度快[12],抗逆性强,产多种活性次级代谢产物[13],包括细菌素和脂肽等抗菌物质[14]、各种水解酶如淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等特点。此外,芽孢杆菌还广泛应用于植物病害的生物防治中,是一种重要的生防菌株,所产细菌素、酶类、活性蛋白质以及一些未知蛋白,在抑制植物病原菌方面发挥巨大的作用[15]。

本试验拟从自然生境中筛选产蛋白酶芽孢杆菌,通过分子生物学和形态学方法对菌种进行鉴定,分析菌株所产蛋白酶的酶学特性,为蛋白酶以及芽孢杆菌在发酵饲料、生物饲料以及饲料添加剂的生产制备中提供材料并奠定理论基础,也为其在植物病害生物防治中的应用提供一些参考。

1、材料与方法

1.1试验样品

肠道内容物样品取自健康昆明(KM)小鼠,饲养条件为温度24℃,湿度45%左右,12h光照黑暗间隔交替,全价颗粒饲料饲喂至10周龄后,进行解剖,取肠道内容物置于无菌离心管中,4℃保存。

1.2主要仪器设备

生物显微镜(型号为CX31)购于奥林巴斯有限公司;酶标仪(ReadMax1000F)购于上海闪谱生物科技有限公司。

1.3主要试剂和培养基

蛋白胨、酵母浸粉均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸氢二钾等均购自国药集团化学试剂有限公司;福林酚购于北京索莱宝科技有限公司。芽孢杆菌初筛固体培养基:蛋白胨5.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖10.0g、磷酸氢二钾4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL、pH=7.0;产蛋白酶筛选固体培养基:芽孢杆菌初筛固体培养基加2%脱脂奶粉或酪蛋白;液体发酵培养基:蛋白胨5.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖10.0g、磷酸氢二钾4.0g、蒸馏水1000mL、pH=7.0;按照以上配方准确称取药品并完全溶解后,在121℃,0.11MPa的条件下,灭菌25min,冷却到常温或者倒平板后接种使用。

1.4产蛋白酶芽孢杆菌的筛选

1.4.1初筛

取1g样品置于无菌离心管,加入10mL灭菌生理盐水,于摇床中振荡均匀,然后将其置于80℃水浴中处理15min,杀死非芽孢菌体,再用灭菌生理盐水进行梯度稀释,将适当稀释的样品涂布在芽孢杆菌初筛固体培养基上,37℃培养24～48h待平板上长出单菌落。

1.4.2复筛

挑取初筛平板上生长情况良好的单菌落分离纯化后接种于产蛋白酶筛选固体培养基中,37℃培养24～48h,观察长出的单菌落周围是否产生透明圈。选取透明圈明显的单菌落进行液体摇瓶培养,37℃培养24～48h后取菌液12000r/min离心5min,使用福林酚法测定上清液中蛋白酶活力,选取蛋白酶活力最高的菌进行后续试验分析。

1.5产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

1.5.1形态学鉴定

挑取单菌落接种于芽孢杆菌固体培养基,37℃培养24～48h,观察固体平板上长出单菌落的形态特征,对其进行革兰染色,镜检观察菌体形态特征。

1.5.2分子生物学鉴定

将单菌落接种于芽孢杆菌液体培养基中,37℃培养12～24h,提取新鲜菌液基因组,PCR获取16SrDNA后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,对获取的测序结果在NCBI上进行BLAST分析菌种信息。

1.6蛋白酶酶学特性分析

1.6.1蛋白酶活力的测定

将发酵菌液12000r/min离心5min,上清液即为粗酶液。蛋白酶活力的测定方法参考中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T10317—1999),使用福林酚法[16,17]进行测定。酶活力定义:在一定pH和温度下,每分钟水解酪蛋白生成1μg酪氨酸对应的酶量为一个酶活单位(U)。

1.6.2蛋白酶最适反应温度的测定

在一定pH条件下,分别测定粗酶液在20、30、40、50、60、70及80℃条件下的蛋白酶活力,确定最适反应温度。

1.6.3蛋白酶最适反应pH的测定

在一定温度下,分别测定粗酶液在pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0条件下的蛋白酶活力,确定最适反应pH。

1.6.4蛋白酶温度稳定性的测定

将粗酶液分别在20、30、40、50、60、70及80℃条件下,水浴处理30min,然后在最适反应条件下测定粗酶液的剩余蛋白酶活力,分析蛋白酶的热稳定性。

1.6.5蛋白酶pH稳定性的测定

将粗酶液分别在pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0条件下处理30min,然后在最适反应条件下测定粗酶液的剩余蛋白酶活力,分析蛋白酶的pH稳定性。

1.6.6金属离子对蛋白酶活力的影响

将粗酶液分别加入到终浓度为5mmol/L的各种金属离子盐溶液、EDTA和尿素溶液中,以未加金属离子的粗酶液作为对照,测定蛋白酶活力,分析不同金属离子和化学试剂对蛋白酶活力的影响。

1.7菌株生长情况和产酶情况分析

挑取划线平板上的芽孢杆菌单菌落,接种于液体发酵培养基中,37℃200r/min过夜培养12～16h,以此为种子液。将种子液以1%的接种量接种到液体发酵培养基中,37℃200r/min条件下进行培养,每隔2h取一次样,分别测定样品的菌液浓度(OD600)和蛋白酶活力,并分析该菌株的生长情况和产蛋白酶规律。

2、结果与分析

2.1产蛋白酶菌株的筛选与鉴定

2.1.1菌株筛选

以小鼠肠道内容物为样品,将初筛获得的菌株进行产酶检测,如图1所示,筛选到两株产蛋白酶菌,分别命名为SC-1和SC-2,测定其发酵液上清的蛋白酶活力,发现SC-2发酵上清液的蛋白酶活力(46.3U/mL)高于SC-1发酵上清液的蛋白酶活力(6.9U/mL),因此选取SC-2作为目的菌株进行后续分析。

图1产蛋白酶菌产生透明圈示意

2.1.2菌株形态学鉴定

菌株SC-2在平板上的菌落形态如图2A所示,菌落色暗呈乳白色,圆形,不透明,表面干燥呈褶皱状;经革兰染色镜检后发现该菌为革兰阳性菌,如图2B所示,镜检可见单杆或双杆菌,(1～2)μm×(15～20)μm,圆端。

2.1.3分子生物学鉴定

测序后,将该菌16SrDNA序列信息在NCBI进行BLAST比对后发现SC-2菌株与特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis,GenBank登录号:KC172005.1)具有99%的相似度,因此鉴定菌株SC-2为特基拉芽孢杆菌。

图2SC-2的菌落形态(A)和革兰染色镜检(B)

2.2蛋白酶酶学特性分析

2.2.1最适反应温度

如图3A所示,该菌所产蛋白酶的最适反应温度为50℃,在40～70℃能够发挥80%以上的酶活,在30℃能够发挥70%的酶活,说明该酶较适合作为饲料用酶。

2.2.2最适反应pH

如图3B所示,该蛋白酶能够在pH值为8.0条件下发挥最大酶活,在pH值为7.0～9.0之间能够发挥90%以上的酶活,在pH值为6.0条件下能够发挥接近80%的酶活力。

2.2.3温度稳定性

为了研究蛋白酶在不同温度下的耐受性,将粗酶液分别在20、30、40、50、60、70及80℃条件下处理30min,然后在pH8.0,50℃条件下测定剩余酶活,结果如图4A所示,该蛋白酶在30℃下稳定性最好,而在20℃处理30min后,剩余酶活为74%,说明低温对此蛋白酶的活性有一定影响,长期低温处理可能会降低酶活。随着处理温度升高,剩余酶活下降,在70℃处理30min后剩余酶活接近50%,而在80℃条件下处理30min后剩余酶活仅为12%,说明此酶对高温有一定的耐受性,但是超过70℃后稳定性表现较差,因此若要进行饲料制粒,则需对其进行一定的保护。

2.2.4pH稳定性

为了研究蛋白酶对不同酸碱环境的耐受性,将蛋白酶分别在pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0条件下处理30min,然后在最适反应条件下测定剩余酶活,结果如图4B所示,该蛋白酶在pH为6.0条件下处理30min,剩余酶活接近80%,稳定性较好;在pH值5.0～9.0之间处理30min后,剩余酶活达到60%以上,表现出一定的稳定性;在pH值为10.0的条件下处理30min仍能够保持接近40%的酶活,说明该蛋白酶在中性和弱酸、弱碱条件下均有较好的稳定性。

图3蛋白酶的最适反应温度(A)和pH(B)

图4蛋白酶的温度(A)和pH(B)稳定性分析

2.2.5金属离子对酶活的影响

如图5所示,Ca2+和Mn2+能够显著提高酶活(P<0.05),Zn2+、Mg2+、Cu2+和EDTA、尿素溶液对蛋白酶活力具有显著抑制作用(P<0.05)。

图5不同金属离子和试剂对蛋白酶活性的影响

2.3菌株生长情况和产酶规律

该菌的生长情况和产酶规律如图6所示,0～4h为迟缓期,4～16h为对数生长期,16h菌体量达到最大,16～48h为稳定期,菌体量基本不再变化,若再延长时间进行培养,则会进入衰亡期,由于营养物质不足以维持菌体生长代谢,导致菌体死亡、崩解,菌体量下降;0～8h处于该菌生长的迟缓期和对数生长初期,因此蛋白酶分泌的量少,酶活上升速度较慢,8～22h处于该菌的对数生长期和稳定期初期,因此蛋白酶分泌量多,酶活上升速度较快,22h蛋白酶活力达到最大值(57.77U/mL),在22～26h蛋白酶活力略微有所下降,可能由于菌体量过多,营养物质消耗过快导致酶的分泌略微减少,随后在26～48h菌体生长稳定期,蛋白酶活力基本保持不变。

图6菌株SC-2的生长曲线和产酶曲线

3、讨论

3.1产蛋白酶的特基拉芽孢杆菌

作为饲料酶制剂,酸性蛋白酶能够在动物的胃部发挥水解作用,对动物摄入的饲料进行初步降解,中性蛋白酶能够在家禽的嗉囊和小肠中发挥作用,而碱性蛋白酶可在动物小肠中对蛋白质进行降解[4]。本研究中特基拉芽孢杆菌所产的蛋白酶是一种碱性蛋白酶,在pH为6.0～9.0之间发挥较高酶活,能够在小肠中对蛋白质进行水解;此外,其具备一定的热稳定性和酸碱稳定性,可经受动物胃肠道酸度和饲料加工过程中的热处理,有利于其在饲料业、食品业、洗涤液、制革业以及医药环保等行业的应用[4,18]。与酸性蛋白酶大多来源于真菌不同,碱性蛋白酶和中性蛋白酶大多数来源于芽孢杆菌,比如来源于短小芽孢杆菌的蛋白酶BPP-A分别能够在pH11.0和pH13.0对酪蛋白和玉米胶蛋白发挥最大酶解活力[19]。与众多产蛋白酶微生物相比而言,芽孢杆菌还表现出生长速度快、培养周期短、易于大规模发酵以及基因操作等优点[4,20]。本研究筛选获得的特基拉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)亲缘关系密切,Gatson于2006年首次从墨西哥哈利斯科州(邻近特基拉镇)的大约有两千年历史的样品中分离出的革兰阳性产芽孢杆菌[21]。相对来说,关于特基拉芽孢杆菌的研究开发尚处于起步阶段[22]。有研究从腐坏的干酪中筛选到产碱性蛋白酶的特基拉芽孢杆菌,所产蛋白酶的最适反应条件为pH9.0,30℃[23];也有研究筛选获得产抑菌物质特基拉芽孢杆菌[22,24]、产葡聚糖酶特基拉芽孢杆菌[12]。上述研究表明,特基拉芽孢杆菌可通过其所产抑菌物质抑制植物病原菌的生长而作为一种重要的生防菌,发挥抗菌、促生等作用[24];也可通过其所产水解酶的作用对饲料原料中大分子物质进行降解,开发新型饲料添加剂。因此,本研究所筛选获得的特基拉芽孢杆菌在畜牧业和农业中具有重要的应用潜力和价值。

3.2产酶微生物的筛选

一般而言,对产酶微生物进行筛选的方法,有两种:一是平板法,在含有底物的固体平板培养基中接种待测微生物,观察长出菌落周围是否有透明圈来判定该菌是否产酶,操作较简便;二是酶活检测法,直接对待测菌株的发酵上清液进行酶活测定,从而确定该菌的产酶情况,方法较繁琐。本研究通过平板法筛选出两株产蛋白酶菌株,仅根据透明圈与菌落大小比值难以判断产酶水平的高低[25],进一步又通过酶活测定法精确测定菌株产酶水平的高低,最终使用平板法和酶活测定法相结合来确定目的菌株。

3.3蛋白酶的应用

在所有的蛋白酶来源中,微生物蛋白酶是最重要的一种,在各行各业中都有广泛应用。蛋白质经过蛋白酶水解后,除了氨基酸以外,还能够生成多种活性肽,这些活性肽在食品和饲料行业中都有很重要的价值,能够发挥多种功能,如抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、降低胆固醇、降压、增强免疫力以及调节机体钙的吸收等[26]。本研究筛选获得的特基拉芽孢杆菌所产蛋白酶的最适反应条件为50℃,pH8.0,具备一定的热稳定性,可应用于饲料业和食品加工业,其降解蛋白质生成的活性肽等小分子物质,还能起到益生元的作用,维护肠道健康并提高动物免疫力,有助于推动绿色安全畜牧业的发展。

4、结论

本研究从小鼠肠道内容物中分离筛选出一株产蛋白酶芽孢杆菌,经形态学和分子生物学方法鉴定其为特基拉芽孢杆菌;对其所产蛋白酶的酶学特性进行分析发现,该蛋白酶的最适反应条件为50℃,pH8.0,该酶在高温下具有一定的耐受性,在弱酸、中性和弱碱性条件下表现出一定的稳定性,Ca2+和Mn2+能够显著提高酶活,Zn2+、Mg2+、Cu2+和EDTA、尿素溶液对蛋白酶活力具有显著抑制作用;通过对其生长情况和产酶规律进行分析发现,该酶在16h菌体量达到最大值,在22h上清液中的蛋白酶活力达到最高值(57.77U/mL)。该产酶菌的成功筛选分离,为新型饲料添加剂以及生防菌的开发利用提供了物质基础。

参考文献：

[12]刘晓玲,王金晶,李永仙,等.产β-1,3-1,4-葡聚糖酶特基拉芽孢杆菌BacillustequilensisCGX5-1发酵培养基的优化[J].食品与生物技术学报,2013,32(6):645-650.

[15]刘雪,穆常青,蒋细良,等.枯草芽孢杆菌代谢物质的研究进展及其在植病生防中的应用[J].中国生物防治,2006(1):179-184.

[22]周瑚,邹秋霞,胡玲,等.特基拉芽孢杆菌JN-369的分离鉴定及其抑菌物质分析[J].农药学学报,2019,21(1):52-58.

[24]孙露,单潇潇,蒋建兰,等.一株对稻瘟病菌有抗菌活性的特基拉芽孢杆菌WRN032的筛选及发酵条件优化[J].天然产物研究与开发,2020,32(5):860-866.

赵龙妹,张玲.产蛋白酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学特性分析[J].畜牧与兽医,2021,53(03):59-64.

基金:河南科技大学博士科研启动基金(13480076)