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探究酿酒酵母发酵过程中大鲵肽的使用
摘要：酿酒酵母发酵过程中使用在养殖大鲵肉中所提取的大鲵肽，并就大鲵肽对酵母生长和发酵性能的作用进行分析。结果表明：大鲵肽的浓度不一样所产生的影响效果也不一样。大鲵肽质量浓度为4mg/mL时作用较强。实验结束时，大鲵肽质量浓度为4mg/mL试验组的OD600值比照组增加了0.141，为0.476，发酵液中pH值降低0.15。乙醇含量与比照组相比提高了7.6%（V/V），含量是0.2°Bx。
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酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是食品工业中发酵和焙烤食品时常用的一种重要应用微生物。因此，人们对酿酒酵母增殖及发酵性能的改进进行了多方面的研究，如培养温度、时间、摇床转速、培养基葡萄糖浓度、pH值、柠檬酸浓度、酵母细胞膜透性，以及氮源、氨基酸、激活剂、外源酶等外源添加物等[1-7]。莫芬等人[8]与赵海锋等人[9]研究发现，不同水解度的小麦面筋蛋白水解物对酿酒酵母的发酵性能的促进效果不同。卢敏[10]发现，大豆蛋白水解物对酵母的生长代谢和发酵性能的促进作用高于小麦面筋蛋白，并确定了大豆蛋白水解物起作用的成分。万春燕[11]研究发现，分子量为3kDa的大豆活性肽可以改善酵母细胞的代谢环境，从而提高酵母发酵和代谢能力，减短发酵周期。因此，肽类活性物质是一种潜在的具有提高酿酒酵母发酵能力的活性物质。试验以大鲵肽为对象，研究了其在酿酒酵母发酵过程中的作用，旨为其在发酵过程中的应用提供科学参考依据。
1、材料与方法
1.1 材料
大鲵肽按照王文莉等人[12]的方法制备；酿酒酵母为葡萄酒活性干酵母RV002，购于安琪公司；蛋白胨、酵母浸粉，购于北京奥博星生物技术有限责任公司；淀粉，购于大连黑石礁大商超市；其余试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 发酵液体培养基配制
将葡萄糖75g，酵母浸粉2.5g，蛋白胨5g溶于500mL去离子水中，于121℃条件下灭菌20min。
1.2.2 活化酿酒酵母将0.5g酿酒酵母加到2%的葡萄糖无菌水50mL中（121℃，20min），于35℃条件下活化30min，得到酿酒酵母悬液。
1.2.3 大鲵肽与酿酒酵母共同培养将活化好的酿酒酵母悬液倒入液体培养基中（1∶10，V/V），分别加入0，0.5，1.0，2.0g的大鲵肽，充分摇匀，得到4组样品：0，1，2，4mg/mL。取30mL混合液于50mL三角瓶内（干热法灭菌），在转速150r/min，温度30℃的条件下于摇床内培养。分别在0，6，12，18，24h时，对该发酵过程进行检测。每个时间点进行3次平行检测。
1.2.4 发酵液参数测定发酵液OD600值、pH值、残糖量和乙醇产量的分析按照刘帅[13]的方法进行。
2、结果与分析
2.1 大鲵肽对酿酒酵母增殖的影响
在不同质量浓度的大鲵肽作用下，考查酿酒酵母RV002的生长曲线。大鲵肽与酿酒酵母RV002共同培养酵母生长曲线见图1。由图1可知，活化后的酿酒酵母需经过6h左右的适应期，在6~12h进入酵母生长的对数期，12h后酵母生长速度较对数期有所减缓，18h后酵母生长逐渐进入稳定期。含有1，2，4mg/mL大鲵肽的酿酒酵母在12h后增殖速度明显高于对照组的酿酒酵母（p<0.05）。在发酵结束时，4mg/mL组的OD600值为0.476，较对照组增加了0.141。按照王文莉等人[12]的方法制备的大鲵肽，其分子量小于2000Da。相关研究表明，小分子肽在发酵过程中更容易被酵母细胞利用[8]。而IkedaK等人[14]的研究认为小分子肽可以影响酵母的脂质代谢系统，进而促进酵母的增殖。因此，小分子大鲵肽对酵母生理功能的影响和酵母具体吸收利用大鲵肽的机制，还有待进一步研究。
图1大鲵肽与酿酒酵母RV002共同培养酵母生长曲线
2.2 大鲵肽对酿酒酵母发酵性能的影响
碳源和氮源是酿酒酵母发酵期间的主要营养物质，这些营养物质对酿酒酵母发酵过程中的物质转化有着重要作用。大鲵肽对酿酒酵母RV002糖代谢的影响见图2。由图2可知，在6~18h的发酵期间，添加大鲵肽的3组酿酒酵母消耗葡萄糖的速度明显高于对照组，大鲵肽质量浓度为4mg/mL组消耗糖的速度最高。大鲵肽对酿酒酵母RV002乙醇生成的影响见图3。
图2大鲵肽对酿酒酵母RV002糖代谢的影响；图3大鲵肽对酿酒酵母RV002乙醇生成的影响
乙醇的产量是评价酿酒酵母发酵能力的指标之一，产量高说明酵母的发酵性能高。由图3可知，添加大鲵肽的3组酿酒酵母的乙醇产量高于对照组。在24h酿酒酵母发酵过程中，大鲵肽质量浓度为4mg/mL组的乙醇产量最高，乙醇含量0.071g/mL，与对照组相比乙醇产量提高了7.6%（V/V）。试验结果显示，大鲵肽可以显著提高酿酒酵母的发酵性能。莫芬等人[8]得到了类似的结果，认为小分子面筋蛋白活性肽（<1kDa）可能促进酵母的代谢机制，促进其对糖类物质的利用，进而提高酵母发酵性能。DaCruzSH等人[15]研究表明，酵母发酵过程中乙醇的产量受到氮源结构复杂性的影响。大鲵肽经过时间飞行质谱（MALDI-TOF）测定表明，它的分子量主要为948.365，1020.105，1150.219，1262.864，1435.411，1830.835Da，具有一定的复杂性[12]。肽类物质的结构复杂性可以在一定程度上降低糖代谢物的抑制效应[11]。从试验结果可以看出，大鲵肽具有类似的作用。大鲵肽对酿酒酵母RV002发酵过程中pH值的影响见图4。由图4可知，发酵液的pH值随着时间的增加而降低，大鲵肽添加组的pH值明显低于对照组，经过24h酿酒酵母的发酵，大鲵肽质量浓度为4mg/mL组与对照组最终的pH值分别为3.16和3.26。酿酒酵母发酵过程中，pH值的总体趋势是下降的[16]。
图4大鲵肽对酿酒酵母RV002发酵过程中pH值的影响
3、结论
大鲵肽可促进酿酒酵母的增殖、提高酿酒酵母的发酵能力，不同质量浓度的大鲵肽对酿酒酵母促增殖和发酵性能的影响不同。将大鲵肽与酿酒酵母共同培养24h后，含有4mg/mL大鲵肽组和对照组的OD600值分别是0.476和0.335，糖度分别为4.07和4.10毅Bx，pH值分别为3.16和3.31，乙醇含量分别为0.071和0.066g/mL，乙醇产量提高了7.6%。因此，大鲵肽可以作为提高酿酒酵母性能的外源添加物。
参考文献：
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[2]李聪.酿酒酵母培养条件及发酵培养基的优化[J].中国农学通报,2014,30(9):302-306.
[3]王宝石,李林波,武忠伟,等.高浓度柠檬酸对酿酒酵母生长的抑制效应[J].中国酿造,2018,37(6):56-60.
[4]陈晓青,陈石,袁兴中.酵母细胞膜透性变化对发酵油莎豆粕制乙醇的影响[J].应用基础与工程科学学报,2009,17(5):697-706.
[5]莫芬,赵谋明,赵海锋.小麦面筋蛋白水解物对酿酒酵母增殖和发酵性能的影响[J].食品工业科技,2012,22(33):222-225.
[6]赵海锋,卢敏,周永婧,等.超高浓酿造中小麦面筋蛋白水解物对酿酒酵母代谢的影响[J].华南理工大学学报(自然科学版),2017,45(12):14-19.
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[8]万春燕.大豆活性肽对酵母增殖代谢及啤酒发酵的影响研究[D].广州:华南理工大学,2012.
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陈璟恒,张芙蕊,李和平.16SrRNA测序法检测仓鼠颊囊内细菌种类的研究[J].野生动物学报,2019,40(4):1015-1017.
基金项目:国家自然科学基金项目(31571916)
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