基因组不稳定是肿瘤的标志性特征之一｡各种内外源性基因毒因素如紫外线､电离辐射(ionizeradia-tion,IR)､化学因素､活性氧､DNA复制错误等皆可诱导产生DNA损伤,包括单链断裂(singlestrandbreaks,SSBs)､链间二聚体及双链断裂(doublestrandbreaks,DSBs)等而引起基因组不稳定[1]｡DNA损伤形成后,可激活细胞内称为DNA损伤应答的精密调控反应,招募一系列的损伤应答蛋白到损伤位点,介导细胞周期阻滞修复损伤的DNA或诱导凋亡清除修复无望的细胞,维持基因组稳定性[2-3]｡

DSBs损伤是最为严重的DNA损伤类型,其修复主要通过非同源末端连接(nonhomologousendjoining,NHEJ)和同源重组(homologousrecombination,HR)两种方式[2]｡DSBs损伤形成后其断裂点的组蛋白H2AX(组蛋白H2A变体)139位丝氨酸被迅速磷酸化形成所谓的γH2AX而参与DNA损伤应答过程,用特异性抗体染色后可在荧光显微镜下看到相应的焦点(foci),γH2AXfoci分析已被公认为是DSBs损伤的标志之一[4-5]｡53BP1是另外一种参与DSBs损伤应答的关键蛋白,其foci分析也成为评价DSBs损伤的标志[3]｡RAD51则是参与DSBs的HR修复的关键蛋白之一,用于分析DSBs损伤修复的HR途径[6-7]｡γH2AXfoci分析是目前最常用的DSBs损伤评价指标,然而,近来有研究[8-14]发现γH2AXfoci在某些情况下与DSBs损伤并不完全一致｡因此,本实验通过电离辐射和喜树碱作为不同类型的DNA损伤诱导方法,研究以上几种修复蛋白在DSBs损伤时的动力学变化,探讨各指标用于评估DSBs合理性｡

1、材料与方法

1.1 材料

人肝癌SMMC-7721细胞系为本实验室保存;DMEM培养基及胎牛血清均购自GIBCO公司;抗53BP1抗体购自Thermo公司;抗γH2AX抗体购自Mil-lipore公司;抗RAD51抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司;FITC荧光标记抗鼠和Cy3标记的抗兔二抗均购自Sigma公司;DAPI染料购自Vector公司｡

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SMMC-7721肝癌细胞培养在DMEM高糖培养基中(含10%胎牛血清及1%抗生素),置于含5%CO2的培养箱中37℃连续培养,每1~2d换液,细胞生长至80%~90%汇合度时使用胰酶消化传代｡

1.2.2 X-ray诱导DNA损伤

将细胞接种到细胞爬片上,待其长至对数生长期且汇合度达70%~80%时,X光辐照仪(RX-650)照射2Gy或10Gy,继续培养并分别在照射后1､4､12､24和36h收样进行免疫荧光检测,同时以设未照射组为对照(0h)｡

1.2.3 CPT诱导DNA损伤

将细胞接种到细胞爬片上,待其长至约40%~50%汇合度时用CPT(2μmol/L)持续处理,并分别在处理后3､24和36h收样进行免疫荧光检测,同时设未处理组为对照组(0h)｡

1.2.4 免疫荧光(immunofluorescence,IF)

检测细胞经4%多聚甲醛室温下固定10min,0.3%TritonX-100(PBS配制)通透10min;再经2%BSA(PBS配制)室温封闭30min后,先后用特异性一抗和荧光素标记二抗湿盒内37℃分别孵育30min;最后经DAPI染色并封片后在荧光显微镜下观察结果,每组独立实验至少分析100个细胞的foci数,实验重复3次,取平均值｡

1.2.5 数据处理与统计

实验数据用平均数±标准差的形式表示,显著性分析通过SPSS18.0软件进行,组间均数比较采用t检验或方差分析,率的比较采用卡方检验,以P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01表示差异极其显著｡

2、结果与分析

2.1 电离辐射诱导的γH2AX和53BP1foci分析

分别用2Gy和10Gy的X-ray照射7721细胞诱导DSBs损伤,并在照射后不同时间点收样,通过免疫荧光染色分析γH2AX与53BP1foci动力学变化情况｡结果显示,未照射的细胞几乎无γH2AX及53BP1foci形成,经2Gy剂量照射后γH2AX及53BP1foci数在1h后达到峰值且几乎100%细胞都为γH2AX及53BP1foci阳性细胞,然后随着时间的推移逐渐减少,24h后已基本消失;此外,γH2AX及53BP1foci基本上可以共定位在DNA损伤位点(图1-A､B)｡细胞经大剂量(10Gy)X-ray照射后,γH2AX与53BP1foci数在相应时间点明显多于2Gy照射组,其变化趋势类似2Gy照射组;需要注意的是,随着时间的推移γH2AX及53BP1foci消退速度减慢,直到照射后36h仍有较多foci(图1-C､D)｡这些结果提示:γH2AX与53BP1在细胞DSBs形成后可被募集到损伤部位参与损伤修复进程,随着损伤DNA逐渐被修复,γH2AX与53BP1逐渐恢复到基线水平;而大剂量X-ray照射引起更为严重的损伤,其修复进程相应减缓｡A和C:用抗γH2AX和53BP1抗体染色,分析经X-ray2Gy(A)和10Gy(C)辐照的7721细胞,并计数细胞内相应foci数;B和D:统计分析A和C中γH2AX及53BP1foci数量,误差线代表n=3的标准差｡

图1γH2AX和53BP1foci在IR处理后的动力学变

2.2 电离辐射诱导的RAD51foci动力学变化

7721细胞经2Gy或10Gy的电离辐射后,RAD51oci数均呈现出先上升后下降的趋势｡2Gy剂量组,RAD51foci计数峰值为4h,36h后foci基本消退;而10Gy剂量组foci高峰延迟至12h,且36h后仍有较多foci(图2-A､B)｡结果提示RAD51也参与了细胞DS-Bs损伤修复动力学过程｡A:用抗RAD51抗体染色,分析经X-ray2Gy或10Gy照射的7721细胞,并计数细胞内相应foci数;B:统计分析A中RAD51foci数量,误差线代表n=3的标准差图2RAD51foci在IR处理后的动力学变化Figure2ThedynamicchangesofRAD51fociafterIRtreatment此外,如图3所示,电离辐射诱导的RAD51foci也可与γH2AXfoci共定位,但RAD51foci阳性细胞仅约占所有细胞的20%~30%,而几乎100%细胞产生γH2AXfoci｡这就说明,与γH2AX不同,RAD51仅参与部分DSBs损伤细胞的修复过程｡

图3电离辐射诱导的γH2AX和RAD51foci模式

2.3 CPT诱导的γH2AX和53BP1foci动力学变化

为进一步研究γH2AX和53BP1foci用于评估DNA双链断裂损伤的准确性,我们用CPT(短期处理主要诱导DNA单链损伤,长时间处理引起大量双链断裂)处理细胞不同的时间,然后进行免疫荧光染色分析｡如图4-A和4-B所示:CPT未处理组(对照组)细胞几乎无γH2AX和53BP1foci形成;CPT处理3h组细胞形成两种模式的γH2AXfoci,模式1为亮而离散的类似于电离辐射诱导的foci类型,模式2为小而致密的泛核γH2AX染色(泛核磷酸化),模式1约占γH2AX阳性细胞的(20.67±3.62)%;随着处理时间的延长,呈现模式1型γH2AX染色的细胞比例逐渐增高,CPT处理12h组约占γH2AX阳性细胞的(59.33±2.58)%,而CPT处理24h组约占γH2AX阳性细胞的(79.00±2.12)%｡此外,53BP1foci仅出现在模式1类型的γH2AX阳性细胞,且与γH2AXfoci共定位｡A:经CPT处理7721细胞预示时间点后,免疫荧光分析γH2AX和53BP1foci变化情况(箭头代表模式1,即亮而离散的类似于电离辐射诱导的foci类型;三角代表模式2,即为小而致密的γH2AX泛核磷酸化染色)｡B:统计分析A中γH2AX和53BP1foci阳性细胞比例,误差线代表n=3的标准差｡

图4CPT诱导的γH2AX和53BP1foci的动力学变化

3、讨论

DSBs损伤形成后,γH2AX可在损伤位点迅速形成,30~60min达峰值,随着DSBs修复的完成逐渐消退,其foci数与DSBs数量正相关,故γH2AXfoci分析成为目前评估DSBs修复动力学的最常用指标[4-5]｡53BP1在DSBs损伤后被招募到损伤位点参与NHEJ修复过程,也是广泛应用的DSBs损伤修复评价指标[5]｡Yan等[15]的研究显示,DSBs损伤后,细胞γH2AX和53BP1foci迅速达峰值(1h)且呈现出动力学变化过程｡Tsvetkova等[16]的研究表明,IR诱导细胞DSBs损伤后,γH2AX和53BP1foci数量相当且可共定位;而Reindl等[17]的研究发现,DSBs形成后γH2AX和53BP1foci数量和大小大致相同,但定位存在细微差异｡本研究中,我们首先以X-ray为DSBs损伤诱导剂,研究了γH2AX和53BP1foci的动力性变化｡结果表明(图1),细胞经X-ray(2/10Gy)照射后诱导γH2AX和53BP1foci形成,且二者具有高度一致性(数量相近,能共定位),均在照射后1h达峰值,随时间延长foci数逐渐降低,反映了DSBs损伤的动力性修复过程;需注意的是,高剂量(10Gy)X-ray照射后在各相应时间点γH2AX和53BP1foci数明显多于低剂量照射组｡由此可见,我们的研究结果同国内外报道基本符合,γH2AX和53BP1foci分析均可较为准确地反映电离辐射诱导的DSBs损伤修复过程,是理想的DSBs损伤评价指标｡

RAD51则参与DSBs损伤的HR修复过程,仅在S/G2期细胞的损伤修复中发挥作用[6-7,18]｡AnastasiaTsvetkovazu等[16]的研究表明,DSBs诱导时RAD51foci仅出现在增殖细胞(Ki67阳性)中｡JudithReindl等[17]的超微结构观察发现,RAD51foci仅出现部分53BP1foci阳性细胞可共定位但尺寸小于后者,可能是损伤部位的53BP1foci被驱出后RAD51进入而介导同源重组｡我们的RAD51foci染色结果发现(图2-A､B,图3):1)RAD51foci也在损伤诱导后呈现动力性变化,照射后4h达峰值,以后逐渐消退;2)与γH2AXfoci(几乎100%细胞阳性)不同,仅有20%~30%的细胞产生明显的RAD51foci｡这与RAD51仅参与S/G2期细胞的HR修复的研究结果一致｡

最近有研究表明,γH2AX诱导可不依赖于DSBs损伤,单链损伤､复制阻滞及凋亡等均可诱导γH2AX形成[8-14]｡

为进一步探讨γH2AX和53BP1foci与DSBs损伤的一致性,我们采用DNA拓扑异构酶抑制剂CPT作为DNA损伤诱导剂,其可诱导的损伤类型较为复杂,包括单链损伤和双链断裂损伤等[4]｡我们的结果(图4-A､B)显示,CPT处理后细胞形成两种模式的γH2AX染色,亮而离散的foci和泛核磷酸化;53BP1foci仅出现在亮而离散的γH2AXfoci阳性细胞中,且与γH2AXfoci共定位;这就提示γH2AX泛核磷酸化很可能与DSBs损伤不相关｡我们还发现,短时间(3h)处理后,γH2AX染色以泛核磷酸化为主,随着处理时间的延长,γH2AX染色逐渐转向以亮而离散的foci为主;我们推测CPT短时间作用主要引起DNA的单链损伤而形成泛核磷酸化形式的γH2AX,随着作用时间延长,单链损伤逐步积累而形成双链单链,γH2AX染色也相应转变为亮而离散的foci类型｡

本研究系统探讨了DNA损伤时γH2AX､53BP1及RAD51foci的动力性变化及其在DSBs损伤评估中的合理应用｡我们的结果表明,γH2AX和53BP1foci分析均可较准确的用于电离辐射诱导的DSBs损伤修复评价,而RAD51foci分析仅适用于DSBs损伤的同源重组修复｡此外,我们还发现在CPT处理时可形成不依赖DSBs损伤的γH2AX染色｡因此,应用γH2AX染色评估DSBs损伤需保持谨慎,必须充分考虑损伤诱导因素并结合53BP1foci分析等综合评价｡

参考文献:

[1]LORD C J. ASHWORTH A. The DNA damage response and cancer ther-apy[J]. Nature. 2012. 481(7381):287 -294.

[2]VAN ATTIKUM H. GASSER S M. Crosstalk between histone modifica-tions during the DNA damage response [ J]. Trends in Cell Biology.2009. 19(5):207 -217.

[3]CICCIA A. ELLEDGE S J. The DNA damage response: making it safe toplay with knives[J]. Molecular Cell. 2011. 40(2):179 -204.

[4]LÖBRICH M. SHIBATA A. BEUCHER A. et al. gammaH2AX foci a-nalysis for monitoring DNA double - strand break repair: strengths. limi-tations and optimization[J]. Cell Cycle. 2010. 9(4):662 -669.

[5]MARKOVÁ. E. SCHULTZ N. BELYAEV I Y. Kinetics and dose - re-sponse of residual 53BP1/ γ - H2AX foci: co - localization. relationshipwith DSB repair and clonogenic survival[J]. International Journal of Ra-diation Biology. 2007. 83(5):319 -329.

[6]GRAESER M. MCCARTHY A. LORD C J. et al. A marker of homolo-gous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvantchemotherapy in primary breast cancer[J]. Clinical Cancer Research. anOfficial Journal of the American Association for Cancer Research. 2010.16(24):6159 -6168.

[7]ZHAO W. STEINFELD J B. LIANG F. et al. BRCA1 - BARD1 pro-motes RAD51 - mediated homologous DNA pairing[J]. Nature. 2017.550(7676):360 -365.

[8]GAGOU M E. ZUAZUAVILLAR P. MEUTH M. Enhanced H2AX phos-phorylation. DNA replication fork arrest. and cell death in the absence ofChk1[J]. Molecular Biology of the Cell. 2010. 21(5):739 -752.

[9]MEYER B. VOSS K O. TOBIAS F. et al. Clustered DNA damage in-duces pan - nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA -PK[J]. Nucleic Acids Research. 2013. 41(12):6109 -6118.

[10]MARTI T M. HEFNER E. FEENEY L. et al. H2AX Phosphorylationwithin the G phase after UV irradiation depends on nucleotide excisionrepair and not DNA double - strand breaks[J]. Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of America. 2006.103(26): 9891 -9896.

[11]RYBAK P. HOANG A. BUJNOWICZ L. et al. Low level phosphoryla-tion of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated withDNA double - strand breaks[J]. Oncotarget. 2016. 7(31):49574 -49587.

[12]PARSELS L A. PARSELS J D. TANSKA D M. et al. The contributionof DNA replication stress marked by high - intensity. pan - nuclearγH2AX staining to chemosensitization by CHK1 and WEE1 inhibitors[J]. Cell Cycle. 2018. 17(9):1076 -1086.

[13]KATSUBE T. MORI M. TSUJI H. et al. Most hydrogen peroxide - in-duced histone H2AX phosphorylation is mediated by ATR and is not de-pendent on DNA double - strand breaks[J]. Journal of Biochemistry.2014. 156(2):85 -95.

[14]FERAUDY S D. REVET I. BEZROOKOVE V. et al. A minority of focior pan - nuclear apoptotic staining of γH2AX in the S phase after UVdamage contain DNA double - strand breaks[J]. Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of America. 2010.107(15): 6870 -6875.

[15]YAN J. XIE Y. ZHANG Q. et al. Dynamic recognition and repair ofDNA complex damage [ J]. Journal of Cellular Physiology. 2018.8(10): 27971 -27977.

王依朝,樊丽,王红霞,杨思路,崔雅妮,段奕鋆,段静静,任来峰,苏文.γH2AX､53BP1及RAD51焦点用于分析DNA双链断裂损伤[J].生物学杂志,2020,37(1):16-19.

基金项目:国家自然科学基金(批准号:81272696).山西省重大研发计划(社会发展)项目(批准号: 201703D321013).