新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease, COVID-19)自2019年暴发后迅速席卷全球，对人类生命安全和全球经济造成巨大威胁和冲击，国际病毒分类委员会将引起此次疫情的病原命名为SARS CoV-2[1]。21世纪以来，冠状病毒引起3次大规模疫情，分别为严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和目前流行的COVID-19,三者均属冠状病毒科Beta冠状病毒属成员，为单股正链RNA病毒[2]。SARS CoV-2基因组约30 kb, 编码4种主要的结构蛋白，棘突蛋白(spike, S)、核蛋白(nucleocapsid, N)、包膜蛋白(envelop, E)和膜蛋白(membrane, M)[3]。S蛋白由S1和S2亚基组成，是位于病毒表面的同源三聚体结构。S1亚基包括N端结构域(N terminal domain, NTD)和C端的受体结合结构域 (receptor binding domain, RBD),两者均可诱导机体产生中和抗体降低病毒感染，其中RBD蛋白通过识别人血管紧张素转化酶2(human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2)受体介导病毒与细胞黏附[4],因此S1蛋白是抗病毒药物和疫苗设计和研发的重要靶点[5]。

SARS-CoV-2的子代病毒核酸复制需要依赖RNA的RNA聚合酶，由于这种酶缺乏校对能力，增加了子代病毒的突变概率，导致病毒不断变异，使疫情愈发难以防控，新的突变株表现为传染性强和人群中高效、隐蔽传播的特点[6]。2020年10月，Beta变异体首次在南非出现，于原始毒株相比，S蛋白发生9个位点的氨基酸变异，其中位于RBD蛋白的3个氨基酸变异株位点K417 N、E484 K和N501 Y增加了病毒对hACE2受体的亲和力，增强了Beta变异株的免疫逃避能力，降低了现有疫苗的保护效果[7]。

疫情推动了SARS CoV-2疫苗的研发进度，与其他类型疫苗相比，重组蛋白疫苗去除了病原体中与激发保护性免疫无关的成分，具有安全性好、产生高滴度中和抗体等优点[8]。CHO细胞是治疗性抗体和疫苗生产最常用的哺乳动物细胞表达系统，具有在无血清及化学限定培养基中快速生长、分泌较少内源蛋白和复杂翻译后修饰能力的优点[9]。因此，本研究基于SARS CoV-2 Beta变异株S1蛋白为设计靶点，利用CHO细胞表达系统制备S1重组蛋白，并在小鼠中评价其免疫效果，为其疫苗和诊断试剂的研究奠定基础。

1、材料与方法

1.1 质粒、细胞、菌株和病毒

pSN真核表达载体由北京诺思兰德生物技术股份有限公司馈赠；CHO细胞和Vero-E6细胞由本实验室保存；Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；SARS-CoV-2野生株、Beta、Delta、Omicron BA1和Omicron BA2变异株由本实验室保存。

1.2 实验动物

BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 试验材料

2×Flash Master Mix、ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit、DL5000 DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；胶回收试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；XhoⅠ和XbaⅠ限制性核酸内切酶购自北京全式金生物技术有限公司；Gravity flow Strep-Tactin®XT 4Flow® column、Buffer W、Buffer BXT、Buffer XT-R 购自德国IBA Lifesciences公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊抗鼠IgG1-HRP和IgG2a-HRP抗体购自英国Abcam公司；ELISA包被液、TMB单组分显色液购自北京索莱宝科技有限公司；ExpiCHOTM Expression Medium培养液、ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit购自美国Thermo Fisher Scientific公司；SARS CoV-2 Beta变异株RBD蛋白由本实验室保存。

1.4 重组质粒的构建与鉴定

根据世界卫生组织公布的Beta变异株S蛋白氨基酸，针对CHO细胞密码子偏好性进行S1基因的优化与合成，并在N端添加Kozak序列，C端添加HRV 3C位点和Strep标签，获得pUC-Beta-S1基因。以pUC-Beta-S1基因为模板，设计用于连接pSN载体的扩增引物，引物序列分别为S1-F:5′-CACAGTGGCGGCCGC-TCGAGGCCACCATGTTCGTGTTCCT-3′和S1-R:5′-GTTTAAACGGGCCCTCTAGATTACTT-TTCGAACTGGGGGTGG-3′。PCR反应程序为：98 ℃预变性30 s; 98 ℃变性10 s, 65 ℃退火5 s, 72 ℃延伸20 s, 72 ℃终延伸1 min; 40个循环。通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。参照胶回收试剂盒说明书回收目的基因和经XhoⅠ、XbaⅠ双酶切的pSN载体，进行无缝克隆连接，转化至Trans1-T1感受态细胞中，涂布在含卡纳霉素抗性的LB固体培养基，置37 ℃培养箱中12 h。挑选单克隆菌37 ℃、220 r/min培养10 h。按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒，并进行XhoⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.5 重组蛋白表达与鉴定

参照ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit说明书将pSN-Beta-S1重组质粒转染至CHO细胞，在37 ℃含8% CO2的轨道摇床平台上培养7 d, 8 000 r/min离心10 min, 收集培养液上清，进行SDS-PAGE蛋白电泳，半干转转印至NC膜。分别使用 1∶1 000稀释的鼠抗RBD多克隆抗体和1∶1 500稀释的鼠抗Strep标签单克隆抗体，在4 ℃条件下孵育NC膜过夜。二抗使用1∶5 000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP,室温孵育NC膜40 min, 加入ECL发光液进行显影。

1.6 重组蛋白的纯化

使用0.45 μm滤器对重组蛋白表达后的细胞上清液进行过滤，按照Gravity flow Strep-Tactin®XT 4Flow® column使用说明书进行重组蛋白纯化。将纯化后的重组蛋白装入透析袋后浸泡于PBS中进行透析，使用BCA蛋白浓度定量试剂盒对透析后的重组蛋白进行浓度测定，SDS-PAGE蛋白电泳检测重组蛋白表达，薄层色谱分析蛋白纯度。

1.7 小鼠免疫试验

为分析重组蛋白的免疫原性，将20只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为2组，每组10只。通过后肢外侧肌肉注射方式，分别进行Beta-S1重组蛋白联合氢氧化铝佐剂免疫和氢氧化铝佐剂单独免疫，Beta-S1重组蛋白免疫剂量为10 μg/只小鼠，共进行3次免疫，每次免疫间隔14 d。分别于每次免疫后14 d、采集小鼠血液，分离血清，用于特异性抗体和中和抗体检测。

1.8 ELISA检测

取96孔ELISA检测板，分别包被SARS-CoV-2 Beta变异株S1蛋白和RBD蛋白抗原，0.4 μg/孔，4 ℃包被16 h, 弃去孔内液体，PBST洗涤4次；每孔加入200 μL 5%脱脂乳，37 ℃封闭1 h, PBST洗涤2次；PBS从1∶200开始进行2倍倍比稀释待检测小鼠血清，37 ℃孵育50 min, PBST洗涤4次；每孔加入1∶10 000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP二抗，37 ℃孵育30 min, PBST洗涤4次；每孔加入50 μL TMB单组分显色液，37 ℃避光孵育10 min, 加入25 μL终止液终止反应。使用酶标仪在双波长下测定D450和D630值。使用同样的方法对第3次免疫后14 d的小鼠血清中针对S1蛋白的IgG抗体亚型进行检测，二抗分别使用山羊抗鼠IgG1-HRP和山羊抗鼠IgG2a-HRP。判定标准， D值小于0.1按照0.1计算，P/N≥2判定为阳性，阳性D值对应的最大检测血清稀释倍数判定为抗体效价。

1.9 中和抗体检测

第3次免疫后14 d, 采集小鼠血液，分离血清，随机选择5只小鼠血清进行针对SARS-CoV-2 野生株，Beta、Delta、Omicron BA1和 Omicron BA2变异株的中和抗体检测，中和抗体检测在生物安全三级实验室中进行，将待检测血清在56 ℃条件下灭活30 min, 96孔细胞培养板中，从1∶20开始将待检测血清进行2倍稀释，每孔加入等体积的100 TCID50 SARS-CoV-2病毒悬液，56 ℃条件下孵育1 h, 每孔加入105个/mL的Vero-E6细胞悬液，在37 ℃含5% CO2培养箱中培养96 h, 显微镜下记录每孔细胞病变情况，通过Reed-Muench法计算血清中和抗体效价。

1.10 统计分析

数据分析使用GraphPadPrism 9 软件，采用的t检验方法处理数据结果。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,差异显著，具有统计学意义。

2、结果

2.1 重组质粒pSN-Beta-S1的构建与鉴定

以合成的pUC-Beta-S1质粒为模板，扩增用于连接表达载体pSN的Beta-S1基因，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在2 139 bp处出现目的基因条带，与预期大小一致(图1A)。构建的重组质粒pSN-Beta-S1经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，在3 700和2 139 bp处分别出现载体片段和目的基因片段，与预期大小一致(图1B)。将鉴定正确的重组质粒进行测序，与预期结果一致，表明重组质粒pSN-Beta-S1构建成功。

图1 重组质粒pSN-Beta-S1的构建与鉴定   

2.2 重组蛋白Beta-S1的表达与鉴定

重组质粒pSN-Beta-S1转染CHO细胞后，经Western blot鉴定，结果显示，鼠抗RBD蛋白多克隆抗体可与表达的重组蛋白Beta-S1发生特异性结合，在120 kDa处出现条带，与预期大小一致(图2A),鼠抗Strep标签单克隆抗也可与120 kDa处表达的重组蛋白Beta-S1发生特异性结合(图2B),表明重组蛋白Beta-S1在CHO细胞中表达成功。

2.3 重组蛋白Beta-S1的纯化和纯度检测

通过亲和层析法纯化表达的重组蛋白Beta-S1,经SDS-PAGE凝胶电泳显示，得到单一条带，大小约为120 kDa, 与理论大小一致(图3A)。使用薄层色谱扫描分析表达的重组蛋白纯度，结果显示重组蛋白纯度为85.50%(图3B)。

图2 重组蛋白Beta-S1的表达和Western blot鉴定  

图3 重组蛋白Beta-S1的纯化和纯度检测   

2.4 小鼠免疫后血清中特异性IgG抗体检测

重组蛋白Beta-S1联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c后，第1次免疫后21 d, 全部小鼠血清均可检测到针对SARS-CoV-2 S1蛋白和RBD蛋白的特异性IgG抗体，平均抗体效价分别为1∶560和1∶300。第2次免疫后14 d, 针对S1蛋白和RBD蛋白的特异性IgG抗体平均效价分别为1∶12 640和1∶8 240,较第1次免疫分别提高22倍(差异显著，P<0.001)和27倍(差异显著，P<0.001)。第3次免疫后14 d, 针对S1蛋白和RBD蛋白的特异性IgG抗体平均效价分别为1∶133 120和1∶66 560,较第2次免疫分别提高10倍(差异显著，P<0.01)和8倍(差异显著，P<0.01)(图4)。结果表明，重组蛋白Beta-S1免疫小鼠后，具有良好的免疫原性。

图4 小鼠免疫后血清中特异性IgG抗体效价检测   

2.5 小鼠免疫后血清中特异性IgG抗体亚型检测

第3次免疫后14 d, 检测小鼠血清中针对SARS-CoV-2 S1蛋白的特异性IgG抗体亚型IgG1和IgG2a, IgG1抗体平均效价为1∶51 200,IgG2a抗体平均效价为1∶1 560,IgG1抗体平均效价为IgG2a抗体平均效价的32倍(差异显著，P<0.001)。结果表明，重组蛋白Beta-S1免疫小鼠后，主要诱导趋向于IgG1亚型的抗体产生(图5)。

图5 小鼠免疫后血清中特异性IgG抗体亚型检测   

2.6 小鼠免疫后血清中和抗体检测

第3次免疫后14 d, 重组蛋白Beta-S1联合氢氧化铝佐剂免疫组小鼠血清针对SARS-CoV-2 野生株WT,Beta、Delta、Omicron BA1和 Omicron BA2变异株的中和抗体分别为1∶629、1∶1 720、1∶374、1∶77和1∶101(图6),表明重组蛋白Beta-S1免疫小鼠后，不仅可产生较高的针对自身毒株Beta变异株的中和抗体，还可产生针对野生株和Delta、Omicron BA1、Omicron BA2变异株的交叉中和抗体。

图6 小鼠免疫后血清中和抗体检测   

3、讨论

接种疫苗是防控COVID-19最为有效的手段，目前已有包括灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等多种类型SARS-CoV-2疫苗获批上市，其中亚单位疫苗具有安全性好、免疫原性高、运输和生产成本低等优点[10],可通过原核表达系统、酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统等进行制备[11]。大量研究表明S1蛋白存在较多糖基化位点[12],相比其他表达系统，本研究选择的哺乳动物细胞表达系统制备的S1重组蛋白，其结构和翻译后修饰更接近天然蛋白，有助于提高S1重组蛋白的免疫原性。

单纯依靠重组蛋白进行免疫无法达到预期效果，通常需要配伍合适的佐剂提高重组蛋白的免疫效果[13]。目前用于开发SARS-CoV-2亚单位疫苗的佐剂有多种类型，如氢氧化铝、CpG1018、Matrix-M和Montanide ISA 720佐剂等，本研究使用的氢氧化铝佐剂是上市的预防性疫苗中最常用的佐剂，具有良好的安全性和增强体液免疫应答的能力，联合S1重组蛋白免疫小鼠后可产生较高水平的特异性抗体。目前已有多款针对野生株的亚单位疫苗获批上市，Novavax公司研制的名为NVX-CoV2373的亚单位疫苗免疫小鼠后特异性IgG抗体效价为1∶139 000[14]。智飞生物和中科院微生物所联合研发的ZF2001亚单位疫苗免疫小鼠后特异性IgG抗体效价为1∶432 376[15]。本研究基于Beta变异株制备的S1重组蛋白免疫小鼠后针对S1和RBD蛋白的特异性IgG抗体平均效价可达1∶133 120和1∶66 560,与已上市的NVX-CoV2373和ZF2001亚单位疫苗产生的特异性IgG抗体效价接近，表明其在小鼠体内产生了良好的免疫原性，具有进一步研发的潜质。

小鼠特异性IgG1和IgG2a抗体亚型分别代表了Th1和Th2型免疫应答，本研究将制备的S1重组蛋白联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠后，产生的IgG1抗体平均效价为IgG2a抗体平均效价的32倍，诱导的抗体主要偏向Th2型免疫应答。LI等[16]和CORBETT等[17]构建的SARS-CoV-2 DNA和mRNA疫苗免疫小鼠后诱导的特异性抗体主要偏向Th1型免疫应答。MOHANDAS等[18]和CAO等[19]基于铝佐剂研制的SARS-CoV-2灭活疫苗和亚单位疫苗免疫金黄地鼠和小鼠后诱导的特异性抗体主要偏向Th2型免疫应答，与本研究的结果一致，表明基于铝佐剂的亚单位疫苗和灭活疫苗诱导的特异性抗体主要偏向Th2型免疫应答，而核酸疫苗诱导的特异性抗体主要偏向Th1型免疫应答。

SARS-CoV-2的核苷酸通过突变、插入、缺失和重组的方式产生了多种变异株，如Beta、Delta和Omicron等，目前上市的大多数疫苗均针对野生株设计，无法对变异株提供有效的保护[20]。SUN等[21]制备了SARS-CoV-2野生型、Alpha、Beta、Delta和Lambda毒株的RBD蛋白，免疫小鼠后评估了不同变异株间的交叉中和抗体活性，发现制备的Beta变异株RBD蛋白产生了最佳的交叉中和抗体活性。WANG等[22]在小鼠中评价了Beta和Omicron变异株mRNA疫苗的免疫效果，发现Beta变异株mRNA疫苗较Omicron变异株mRNA疫苗 产生了更广谱的保护效。本研究基于CHO细胞表达系统制备了Beta变异株S1重组蛋白，与SUN等[21]和WANG等[22]的报道一致，在小鼠中具有良好的免疫原性，且针对SARS-CoV-2不同变异株均产生了良好的交叉中和抗体活性，为广谱SARS-CoV-2疫苗的进一步研究奠定了基础。

基金资助:长春市科技发展计划资助项目(21ZGY32);吉林省科技发展计划资助项目(20220204030YY);国家重点研发计划资助项目(2021YFC2302500);

文章来源:范泽昌,冯生,梁明征,等.新型冠状病毒Beta变异株S1重组蛋白的制备及免疫效果评价[J].中国兽医学报,2024,44(06):1133-1139.