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探索补肾固金方的最佳提取工艺

2020-09-19 494 上传者：管理员

摘要：目的：优选补肾固金方的最佳提取工艺。方法：以马钱苷含量、出膏率为评价指标,以加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数为因素，使用L9(34)正交试验，优选出补肾固金方的最佳提取工艺。结果：加水量6倍，浸泡时间2h，提取3h，提取2次为最佳提取工艺。结论：经优化的提取工艺合理可行，适于补肾固金方中药物的提取，为补肾固金方的进一步开发研究提供依据。

关键词：
提取工艺
正交试验
补肾固金方
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随着大气污染的日益加重、人口老龄化的发展以及吸烟人群的增加，全球的慢阻肺患病率也整体呈现上升趋势。亳州地处皖北，天气寒冷，空气质量较差，COPD患者人群较多。补肾固金方是亳州市中医院在长期临床应用的基础上，以七味都气丸合参蛤散去丹皮加沉香、核桃肉、鹿角胶、阿胶等优化制膏而成[1]，以益气固本，补益脾肺肾为主。本方既补肺之母又顺及肺之子，补其根本又防其传变，在治疗“喘证”、“肺胀”等疾病(西医称慢性阻塞性肺病COPD)时疗效显著[2]。

为提高生产质量、更好地发挥临床疗效、惠及广大患者，制定出简单、可行的生产工艺及生产标准尤为重要。目前膏方加工多采取传统经验式制作工艺，效率低，能源消耗高，且提取及制备过程因人而异，主观性较强，膏方质量良莠不齐。本实验选择提取工艺相对重要的影响因素：加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数为考察因素[3,4,5]，采用L9(34)正交试验，以马钱苷的含量和出膏率为评价指标，优选最佳提取工艺。

1、仪器与试药

1.1仪器

U3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)；MS205DU十万分之一电子天平(梅特勒—托利多)；XP26百万分之一电子天平(梅特勒—托利多)；JK-300DVB超声仪(合肥金尼克机械制造有限公司)

1.2试药

山药、茯苓、熟地、山茱萸等中药饮片均采购于安徽普仁中药饮片有限公司，并按《中国药典》(2015版)各项规定检查，均符合标准。后经亳州市中医院副主任中药师袁如柏鉴定均为正品。

马钱苷对照品(批号：111640-201707，纯度：99.2%)购于中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸为色谱纯；甲醇为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

2、方法与结果

2.1正交试验设计[6,7,8]

使用L9(34)正交表进行实验，以加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数为考察因素，以马钱苷含量、出膏率为评价指标，因素水平安排见表1。

表1因素水平表

2.2出膏率测定方法

按处方量的1/10量，分别称取各味药材共9份，按正交实验设计方案进行提取，提取后的滤液过4层纱布，置水浴锅上浓缩、定容至500mL，精密量取100mL于恒重的蒸发皿中水浴干燥，再放入105℃恒温烘箱中烘干至恒重，称量。

按公式：出膏率=出膏量/药材总重量*100%，计算出膏率。

2.3马钱苷含量测定

2.3.1溶液的制备

2.3.1.1对照品溶液的制备

精密称取马钱苷对照品(含量以99.2%计)1.081mg置于50mL容量瓶中，加80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度摇匀，制成21.4μg/mL的溶液。

2.3.1.2供试品溶液的制备

取1～9号干膏样品1.0g，分别置于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)45min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得1～9号供试品。

2.3.1.3阴性对照品溶液的制备

取缺少山茱萸药材的样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)45min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得阴性对照品。

2.3.2色谱条件及适用性

图1马钱苷HPLC色谱图

C18色谱柱；乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～5min,5%～8%B;5～19min,8%B;19～45min,8%～19%B;45～50min,19%～60%B;50～60min,60%B)；流速：1.0mL/min；检测波长240nm；柱温为25℃。进样量为5μL。在此色谱条件下，分离效果较好，HPLC色谱图见图1。

2.3.3方法学考察

2.3.3.1线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液1μL、3μL、5μL、7μL、10μL注入液相色谱仪，在“2.3.2”项色谱条件下进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μL)为横坐标(X)，进行线性回归，得马钱苷回归方程Y=0.5697X-0.0137(R2=1)，结果表明马钱苷在0.021～0.214mg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.3.3.2精密度试验

精密吸取对照品溶液5μL，连续进样6次，测定峰面积。结果马钱苷的峰面积RSD(n=6)为1.1%，表明仪器精密度良好。

2.3.3.3稳定性试验

取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、10、12、14h进样5μL测定。结果马钱苷的峰面积RSD(n=8)为0.4%，表明溶液在14h内稳定性良好。

2.3.3.4重复性试验

取同一样品6份，每份约1.0g制备供试品溶液，进样5μL测定。结果马钱苷的峰面积RSD(n=6)为0.57%，表明该方法重复性良好。

2.3.3.5加样回收率试验

精密称取马钱苷对照品(含量以99.2%计)5.023mg于10mL容量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度摇匀，制成每毫升含0.4983mg马钱苷的溶液备用。分别称取补肾固金方6份，每份约0.5g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入上述对照品溶液1Ml。按制备供试品的方法制备成溶液，精密吸取5μL注样测定，计算加样回收率。平均回收率为98.4%,RSD=1.8%。

2.4正交试验方法与结果

取1～9供试品溶液，重复3次，在“2.3.2”项色谱条件下进样5μL，测定马钱苷的平均含量(n=3)。以山茱萸中马钱苷含量和出膏率为评价指标，采用综合评分法进行数据处理，权重系数分别为0.4和0.6。综合评分=(马钱苷含量/马钱苷含量最大值)*40+(出膏率/出膏率最大值)*60。实验设计和分析结果见表2和表3。

表2L9(34)正交实验设计及结果

表3方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

从表2结果和极值R可以看出，四个因素的影响大小依次为C>D>A>B，即提取时间>提取次数>加水量>浸泡时间，A1>A2>A3,B1>B3>B2,C3>C2>C1,D2>D3>D1，最佳提取工艺为A1B1C3D2。表3的方差分析表明，提取时间、提取次数有显著影响(P<0.05)，而加水量、浸泡时间对试验结果差异均无统计学意义(P>0.05)。综合直观分析与方差分析，得到最优提取工艺为A1B1C3D2。

2.5验证试验

为进一步考察上述优选工艺的稳定性，按上述最优提取工艺进行3次平行实验验证。结果，见表4。出膏率RSD=0.15%，马钱苷含量RSD=0.31%，稳定性较好。验证实验的综合评分接近正交实验结果的较高数据，表明优选的工艺条件稳定、可行。

表4验证实验结果

3、讨论

补肾固金方是亳州市中医院的临床经验方，临床上一直使用水煎煮且方中有效成分多为糖类、皂苷等，故用水作为提取溶剂。参考《中国药典》(2015版)，选择组方中药典记载的毛蕊花糖苷(熟地)、马钱苷(山茱萸)、五味子醇甲(五味子)、23-乙酰泽泻醇B(泽泻)、沉香四醇(沉香)共5种为含量测定的潜在指标。由于本膏方采用水提法制备，有效成分可能为水溶性成分，选择马钱苷、毛蕊花糖苷、五味子醇甲为水溶性成分为指标。加之方中五味子为“臣药”含量较低；方中熟地虽为“君药”，但有效成分毛蕊花糖苷含量较低；而方中山茱萸用量较大为“君药”，其有效成分马钱苷含量相对较高[9]，并重在补益肝肾，符合补肾固金方的功效主治，所以选用马钱苷为评价指标。

复方制剂成分众多、复杂多变，只单一从有效成分含量或出膏率难以代表膏方疗效，本实验采用综合分析法，保证指标的全面性，给予关键因素不同的侧重。庞燕梅等[10]在优化温肾降浊方的提取工艺时，分别给予出膏率、甘草酸含量30%和70%的比重；徐扬等[11]对益肾活血方的提取工艺研究，分别给予出膏率60%、浸出物40%的综合评价；申力等[12]分别给予出膏率40%、甘草酸含量60%的评价指标。关键因素选择及侧重的不同与制剂品种、提取工艺等相关，故本实验分别给予马钱苷含量40%，出膏率60%的综合评价。

中药膏方提取工艺的科学性、合理性直接影响药品的质量和临床疗效。为提高药品提取效率、规范提取工艺、满足批量生产需求，本实验提通过L9(34)正交表试验，优选最佳提取工艺。该工艺为补肾固金方的质量控制、推广使用及进一步研究奠定坚实的基础。

参考文献:

[1]马奎军,程玉峰,王艳,等.补肾固金膏干预COPD稳定期合并焦虑抑郁的临床观察[J].中医药临床杂志,2014,26(6):572-574.

[2]程玉峰,马奎军,何蕊,等.补肾固金膏治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期临床观察[J].中医药临床杂志,2014,26(8):798-800.

[3]许树军,邹淑君,王冬梅,等.桂苓五味甘草汤煎膏剂提取工艺研究[J].中医药学报,2012,40(3):115-117.

[4]吴文辉,叶美颜.多指标正交试验优选煎膏剂的水提工艺[J].中华中医药学刊,2015,33(4):1673-7717.

[5]刘凤乐,杨忠进,谢建苗,等.通痹膏的提取工艺研究[J].云南中医中药杂志,2016,37(6):73-75.

[6]黄金玲,王慧慧,陈慧芳,等.正交试验法优选苓桂术甘汤的提取工艺[J].安徽中医学院学报,2011,30(6):65-68.

[7]饶丽,金小冬,李青南,等.正交法优选愈骨葆方的最佳水提取工艺[J].中国中药杂志,2017,42(2):280-284.

[8]张继全,李更青,杨娜,等.正交试验法优选抗瘤增效方的提取工艺[J].海峡药学,2018,30(1):19-22.

[9]俞坚,郑群雄,励建荣.微波提取山茱萸马钱苷的工艺研究[C].第二届中国浙江学术节—食品安全监管与法制建设国际研讨会暨第二届中国食品研究生论坛,2010.

[10]庞燕梅,周福军,胡跃强,等.基于药效筛选和正交试验优化温肺降浊方的提取工艺[J].中草药,2018,49(10):2420-2425.