近年来，我国养殖业迅速发展，畜牧养殖规模化程度不断提高，与此同时，养殖场也会产生饲料、粪便等大量污染物。其中，养殖过程中投加的饲料只有少部分能够被摄食，大部分以粪便和饵料的形式进入水体[1],因此，水中的氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等含氮物质大幅增加，超过水体的自净能力，导致水质恶化，威胁水生生物的生长[2-4]。

生物脱氮技术相较物化脱氮方法具有高效、低成本且对环境危害小等特点，受到国内外的广泛关注[5]。传统的生物脱氮工艺主要包括自养硝化和缺氧反硝化两个阶段[6],但是需要在不同的反应器内完成，不但增加成本而且占地面积较大[7]。同时，高浓度氨氮和亚硝酸盐氮还会抑制硝化细菌的生长[8]。因此，出现了一些新型生物脱氮工艺，例如厌氧氨氧化法，短程硝化反硝化法。厌氧氨氧化是在厌氧条件下细菌以NO-N产生N2的过程[2]。但是厌氧氨氧化细菌一般是自养菌，生长增殖缓慢，难以形成优势菌[3],导致脱氮系统启动困难，并不适用于小规模的脱氮场景中，如水量较少且含氮浓度较低的养殖尾水的处理中。短程硝化反硝化是将硝化过程控制在生成亚硝酸盐阶段，再经反硝化作用转化为气态氮[4]。该工艺受温度、溶解氧和pH的影响较大，在长期运行中并不稳定。有研究者提出以异养硝化好氧反硝化为代表的新型生物脱氮理论和技术[9],该技术不仅减少了反应器的使用数量，还减少了不同异养生物对碳源的竞争[10],同时，好氧反硝化菌可以利用多种碳源维持反硝化反应稳定进行，从而快速成为优势菌株[11-12],在养殖废水处理等领域应用广泛。因此，异养硝化好氧反硝化种质资源的积累尤为重要。

本研究从天津某养殖塘的活性污泥中筛选出一株能够高效去除氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的不动杆菌Acinetbactersp. ZH7,确定了菌株的生长及异养硝化和好氧反硝化最优化条件；研究了菌株在单一氮源和混合氮源存在时的脱氮性能，探究菌株ZH7在去除氮源过程中的动力学特性。研究为处理含氮废水提供候选菌源以及理论依据和技术支撑。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

本研究所用泥样取自天津市某养殖塘。

1.1.2 培养基

固体培养基(g/L):牛肉膏5.0 g, 蛋白胨10.0 g, NaCl 5.0 g, 琼脂20.0 g, pH 7.0～7.2,用于菌株的保存及形态观察。

富集培养基(g/L):CH3COONa 3.320 g, KNO30.300 g, NH4Cl 0.305 g, KH2PO40.040 g, MgSO4·7H2O 0.091 g, CaCl2·2H2O 0.026 g, NaCl 0.020 g, pH 7.0～7.2。

筛选培养基(g/L):C4H4Na2O48.5 g, KNO31.0 g, K2HPO41.0 g, MgSO4·7H2O 1.0 g, CaCl2·2H2O 0.2 g, BTB(1%溶于酒精)1.0 mL,琼脂20.0 g, pH 7.2。

异养硝化培养基(g/L):CH3COONa 4.099 g, NH4Cl 0.382 g, 维氏盐溶液50.0 mL,pH 7.0。

好氧反硝化培养基(g/L):CH3COONa 5.465 g, KNO30.720 g(或NaNO20.490 g),维氏盐溶液50.0 mL,pH 7.0。

维氏盐溶液(g/L):K2HPO45.00 g, MgSO4·7H2O 2.50 g, NaCl 2.50 g, MnSO4·4H2O 0.05 g, FeSO4·7H2O 0.05 g。

以上培养基均经121 ℃湿热灭菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集筛选及分离

将10 g泥样加入90 mL无菌水中，置于180 r/min、30 ℃摇床中振荡24 h, 静置，取上清液10 mL接种于富集培养基，梯度稀释后将稀释液涂布于BTB(溴百里酚蓝指示培养基)固体平板，变色范围pH 6.0(黄)～7.6(蓝)。细菌具有反硝化能力能够将NO-N或NO-2-N还原成气态氮，从而导致pH升高。将平板置于培养箱中30 ℃培养1～2 d, 挑选周围培养基出现蓝色菌落作为候选菌株。将分离出的单菌落分别接种于异养硝化和好氧反硝化培养基中，在30 ℃、180 r/min摇床中培养24 h, 测定NH-N的去除率，并选取脱氮能力最佳的1株命名为ZH7,用作后续实验研究。

1.2.2 菌株的鉴定

形态观察参考文献[13]的方法制备扫描电镜样品并观察菌株的形态特征。生理生化试验参照文献[14]测定菌株相关生理生化指标。

16S rDNA鉴定：选用细菌通用引物(上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16S rDNA扩增，扩增产物送至苏州安升达生物科技有限公司测序，将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，并采用Bioedit、Mega 7.0等软件进行系统进化分析，用Neighbor-Joining法构建系统发育树。用Kimura two-parameter distance模型计算进化距离，1 000次随机抽样，计算自引导值以及评估系统发育树的置信度。

1.2.3 分析方法

-N采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535—2009)[15];NO

-N采用紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)[16];NO

-N采用分光光度法(GB 7493—1987)[17];OD600采用分光光度法。

去除率η的计算公式：

式中，C0表示0 h对应氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的质量浓度，mg/L;Ct表示某时刻对应氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的质量浓度，mg/L。

1.2.4 环境因素对菌株生长及脱氮能力的影响

以100 mL异养硝化培养基(含NH

-N 100 mg/L)为基础，设置C/N=20不同类型的碳源(丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖)、C/N(4、8、12、16、20)、初始pH(4、5、6、7、8、9、10)、培养温度(20、25、30、35和40 ℃)、转速(90、120、150、180和210 r/min)、NaCl质量浓度(0、10、20、30和40 g/L)进行单因素实验。培养24 h取样，测定OD600及NH

-N的含量。以上实验均设3组平行。

1.2.5 菌株对不同氮源的脱氮性能

在最佳培养条件下，将菌悬液接入到分别含有NH

1.2.6 菌株去除不同氮源的动力学分析

菌株ZH7对不同氮源的去除过程采用修饰过的Compertz模型[18-19]进行拟合。

式中，S表示某一时刻氮素的质量浓度，mg/L;S0表示氮素的初始质量浓度，mg/L;Rm表示最大转化速率，mg/(L·h);t0表示迟滞时间，h;t表示反应时间，h; e是自然常数。

2、结果与分析

2.1 菌株的鉴定

2.1.1 菌株的形态以及生理生化特征

菌株ZH7在LB平板上呈圆形，表面光滑、湿润，乳白色、不透明，边缘整齐[图1(a)]。扫描电镜下观察，菌体为短杆状，表面有微小褶皱[图1(b)]。菌株的生理生化实验结果如表1所示。菌株ZH7形态以及生理生化特征与常见Acinetobacter属细菌相似。

图1菌株ZH7的菌落形态图(a)和扫描电镜照片(b)

表1菌株ZH7的生理生化实验结果

2.1.2 16S rDNA鉴定

菌株ZH7基于16S rDNA的系统发育树分析如图2所示。根据同源性结果分析该菌株是不动杆菌属(Acinetbactersp.)。该菌株的基因序列已提交至NCBI,其注册号为OR426450。

图2菌株ZH7基于16S rDNA基因序列的系统发育分析

2.2 不同环境因素对菌株生长和脱氮作用的影响

2.2.1 不同碳源对ZH7生长及脱氮作用的影响

不同碳源对菌株生长、异养硝化和好氧反硝化过程的影响，如图3所示。当以丁二酸钠和乙酸钠为唯一碳源时，菌株生长良好(OD600>2.0),NH

-N的利用率较低。这可能是因为菌株ZH7更容易利用乙酸钠等小分子有机酸生长且同时完成氮的高效脱除[18]。因此，选取乙酸钠为后续实验的最佳碳源，与文献报道的其他除氮菌株易利用的碳源不同，这可能是由于不同菌株对碳源有不同的偏好[20]。

2.2.2 不同C/N对ZH7生长及脱氮作用的影响

不同C/N对菌株的生长及脱氮能力的影响如图4所示。在一定范围内，C/N越高，菌株的生长和脱氮效果越好，但碳源过多，既会影响水质，也会造成资源浪费[21]。由图4 (a)可知，当C/N=4时，菌株ZH7对NH+4-N和NO

-N的去除率分别为57.19%和39.37%。此时由于碳源不足导致菌株的生长受到限制，代谢缓慢，脱氮能力较低；当C/N=8时，NH

-N的去除率可达到93.89%,C/N继续升高菌株生物量会增加，但是NH+4-N去除率并没有明显的提升，菌株的代谢活动趋于稳定[22]。当C/N>12时，OD600和NH

-N的去除率均趋于稳定，因此，选取C/N=12作为异养硝化过程中的最佳碳氮比。如图4(b)所示，在好氧反硝化过程中，当C/N<16时，菌株的生长和脱氮能力随着C/N的升高而升高，这可能是由于碳源的增加提供了更多的电子受体，促进了反硝化过程的进行。C/N从16上升到20时，硝酸盐氮的去除效率保持在95%以上，菌株的生长和反硝化能力保持稳定，这可能是因为以NO

程[23]。

图3碳源对菌株ZH7生长及异养硝化(a)和好氧反硝化(b)过程的影响

2.2.3 不同pH对ZH7生长及脱氮作用的影响

不同pH对菌株生长、异养硝化和好氧反硝化过程的影响如图5所示。pH为7～9时，菌株生长能力较好，NH

-N的去除率均能达到95%以上。pH=10时，在异养硝化培养基中菌株的生长受到抑制，但

-N去除率没有明显变化，在好氧反硝化培养基中菌株的生长及脱氮能力都有降低，这可能是因为反硝化过程释放的OH-导致培养基中pH增大，微生物酶活性受到抑制，导致菌株的生长及脱氮能力下降[22]。以上实验结果说明中性或偏碱性环境更能促进菌株的生长与异养硝化-好氧反硝化作用，最佳pH应为7～9。

图4 C/N对菌株ZH7生长及异养硝化(a)和好氧反硝化过程的影响(b)

图5 pH对菌株ZH7生长及异养硝化(a)和好氧反硝化(b)过程的影响

2.2.4 不同温度对ZH7生长及脱氮作用的影响

不同温度对菌株生长、异养硝化和好氧反硝化过程的影响如图6所示。在一定范围内，随着温度升高，菌株的生长和氮素去除率增加。当温度为30 ℃时，NH

-N的去除率最高，分别为98.27%和99.63%,菌株的生长状况最好，所以最适温度为30 ℃。实验表明，该菌在温度为20～40 ℃范围内，其NH

-N去除率均在95%以上，NO

-N去除率可达60%,说明该菌株有较宽的温度适应范围，这也是该菌相比其他异养硝化-好氧反硝化菌的一个重要优势。

图6温度对菌株ZH7生长及异养硝化(a)和好氧反硝化(b)过程的影响

2.2.5 不同摇床转速对ZH7生长及脱氮作用的影响

培养基内的溶解氧含量与摇床转速有关，氧气作为异养硝化与好氧反硝化过程中的电子受体，对菌株的生长及脱氮性能均会有所影响[10]。不同转速对菌株生长、异养硝化和好氧反硝化过程的影响如图7所示。在一定范围内，随着摇床转速的增加，培养基中的溶解氧增加，菌株的生长及脱氮能力会增强，培养基中的溶解氧增加，菌株的生长及脱氮能力会增强。当转速为120 r/min以上时，NH

-N去除率可达到80%以上，生物量OD600约为2.0;当转速增加为210 r/min时，脱氮效果和生物量均降低，推测原因可能是过高的溶解氧抑制了菌株生长和酶的活性。有研究表明，氧气和硝酸盐可以同时作为电子受体参与到微生物的新陈代谢过程中。但存在电子在氧气和硝酸盐之间的分配问题。因此，溶解氧对反硝化过程具有重要影响，当溶解氧量低时菌量也较低，反硝化作用较弱；而随着溶解氧量增加菌量增加，反硝化作用也随之增强，此时电子供体更倾向于硝酸盐还原[24]。综合以上结果选择180 r/min为实验最佳摇床转速。

图7摇床转速对菌株ZH7生长及异养硝化(a)和好氧反硝化(b)过程的影响

2.2.6 不同NaCl质量浓度对ZH7生长及脱氮作用的影响

不同NaCl质量浓度对菌株生长、异养硝化和好氧反硝化过程的影响，如图8所示。当NaCl质量浓度低于20 g/L时，菌株对NH

-N的去除率大于75%,OD600为1.73。由此可见，异养硝化过程中菌株可以在NaCl质量浓度为0～20 g/L条件下生长。当NaCl质量浓度升高到30 g/L时，菌株几乎不能去除NH

-N,OD600仅为0.1。这可能是因为NaCl质量浓度过高会形成高渗透压的环境，导致细胞质壁分离，从而使微生物丧失活性[25]。在好氧反硝化过程中，当NaCl质量浓度低于10 g/L时，菌株对NO

-N的去除率大于70%,随着NaCl质量浓度升高，NO

-N的去除受到明显抑制。Song等[26]的实验结果表明，NaCl质量浓度升高，异养硝化会成为异养硝化好氧反硝化菌的主要的代谢途径。综上，NaCl质量浓度升高对好氧反硝化过程的抑制作用更为明显。

图8 NaCl质量浓度对菌株ZH7生长及异养硝化(a)和好氧反硝化(b)过程的影响

2.3 菌株的脱氮性能及动力学研究

2.3.1 菌株的异养硝化性能

如图9所示，以NH

-N为单一氮源时，探究菌株的异养硝化性能及生长特性。菌株在初始4 h内处于停滞期，随后菌株迅速生长，在24 h时OD600达到最大值1.745。由图可知，对NH

-N的去除主要发生在菌株的对数生长期，这与Wang等[27]的研究结论一致，说明脱氮过程与细胞生长密切相关[28]。氨氮的最大去除速率为12.61 mg/(L·h),相较其他相关报道有着较好的去除率[18,29]。在该过程中，NO

-N的最大积累量分别为6.81 mg/L和0.05 mg/L,随后二者的质量浓度均会下降。这可能是菌株具有同步硝化反硝化功能，说明硝化作用的产物可以作为反硝化作用的底物被利用，这一结论与Yao等[29]的研究结果一致。

2.3.2 菌株的好氧反硝化性能

如图10所示，以NO

-N为单一氮源时，探究菌株的好氧反硝化性能及生长特性。菌株经过4 h的迟缓期后迅速生长，在24 h时OD600达到峰值2.11。在4～20 h, 菌株生物量迅速增大，同时NO

-N浓度增加，推测可能是后期碳源不足，部分细菌衰亡所导致。

图9菌株ZH7以氨氮为唯一氮源时的脱氮性能及生长特性

图10菌株ZH7以硝酸盐氮(a)、亚硝酸盐氮(b)为唯一氮源时的脱氮性能及生长特性

2.3.3 菌株的异养硝化-好氧反硝化性能

如图11所示，NH

图11菌株ZH7以氨氮和硝酸盐氮为混合氮源时的脱氮性能及生长特性

2.3.4 菌株对氮素去除的动力学分析

如表2所示，菌株ZH7降解不同氮素的动力学参数及最终去除率。如图12所示，菌株ZH7对氮源的去除与修饰的Compertz模型配适度高，拟合所得R2均大于0.99。菌株ZH7在去除不同氮源时均存在迟滞期，对NH

-N的利用速率显著高于NO

-N为唯一氮源时，迟滞时间(t0=6.13 h)最长，可能是在菌株生长初期对NH

-N的利用。由此可见，菌株ZH7对不同氮源均有较好的适应性，具有高效的脱氮能力，在生物脱氮领域具有较为广阔的应用前景。

表2菌株ZH7降解不同氮素的动力学参数及去除率

3、结论

本研究分离鉴定了一株高效异养硝化-好氧反硝化菌ZH7,并对其脱氮性能进行初步研究。本研究结论主要有以下几点：

(1)在养殖塘底泥中筛选分离得到一株高效异养硝化-好氧反硝化菌ZH7,鉴定为Acinetbactersp.,通过单因素实验确定该菌株最佳碳源是乙酸钠，在温度20～40 ℃、pH 7～9、NaCl质量浓度10 g/L、最佳C/N是12～16条件下，对氨氮和硝酸盐氮均有较好的去除效果。

图12菌株ZH7去除单一氮源(a)、混合氮源(b)的拟合曲线

(2)菌株ZH7有高效的异养硝化-好氧反硝化能力，对氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的去除率均达到99%以上，并能够高效处理多种氮源同时存在的含氮废水。菌株ZH7在氨氮和硝酸盐氮混合氮源存在的条件下会优先利用氨氮，在该过程中亚硝酸盐氮只有少量积累，对水生生物的危害较小。

(3)利用改良Compertz模型对其脱氮特性有较好拟合效果，最大转化速率Rm排序为氨氮>亚硝酸盐氮>硝酸盐氮。

本研究为养殖废水生物脱氮提供了高效的候选菌株，其相关脱氮研究对含氮废水的生物脱氮具有一定的理论意义和潜在应用价值。但是，目前对该菌株的研究还只限于实验室阶段，釆用人工配制的模拟废水。今后可以尝试将菌株ZH7应用于实际含氮废水的处理，考察其对实际含氮废水的脱氮能力，为养殖废水生物脱氮提供理论依据和参考。

参考文献:

[2]于文杰.一株异养硝化细菌处理循环水养殖废水的研究[D].上海:上海海洋大学,2014.

[3]侯鹏飞.反硝化聚磷菌Pseudomonas chloritidismutans K14的脱氮除磷特性及应用潜力初步研究[D].天津:天津农学院,2022.

[4]王紫琪.异养硝化好氧反硝化菌X1-L的筛选鉴定及脱氮特性研究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2020.

[6]张婷月,丁钰,黄民生.异养硝化-好氧反硝化细菌的筛选及其脱氮性能研究[J].华东师范大学学报(自然科学版),2018(6):22-31,87.

[8]王泽斌,马云,王强.含氮废水生物处理技术研究现状及发展趋势[J].环境科学与管理,2011,36(9):108-112.

[13]白洁,郭晓旭,康兆颜,等.一株异养硝化-好氧反硝化菌Pseudomonas sp.GK-01的筛选及脱氮能力研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2019,49(S1):74-84.

[14]布坎南,吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社,1984:833-854,865-870.

[15]环境保护部.水质氨氮的测定——纳氏试剂分光光度法:HJ 535—2009[S].北京:中国环境科学出版社,2010:1-4.

[16]环境保护部.水质硝酸盐氮的测定——紫外分光光度法(试行):HJ/T 346—2007[S].北京:中国环境科学出版社,2007:1-2.

[17]国家环境保护总局.水质亚硝酸盐氮的测定——分光光度法:GB 7493—1987[S].北京:中国标准出版社,1987:1-5.

[18]杨垒,陈宁,任勇翔,等.异养硝化细菌Acinetobacter junii NP1的同步脱氮除磷特性及动力学分析[J].环境科学,2019,40(8):3713-3721.

[19]刘方剑.一株高效异养硝化-好氧反硝化细菌WZ17的筛选及其脱氮特性研究[D].温州:温州大学,2020.

[20]朱云,龚望宝,谢骏,等.好氧反硝化细菌的鉴定及其脱氮特性研究[J].水生生物学报,2020,44(4):895-903.

[21]邹玉兰.好氧反硝化细菌Acinetobacter haemolyticus ZYL的脱氮性能及其代谢机理研究 [D].太原:太原理工大学,2020.

[22]李惺惺.好氧反硝化菌的筛选及脱氮性能研究[D].北京:中国石油大学(北京),2016.

[23]赵惊鸿,黄少斌.一株耐高温好氧反硝化菌的筛选及特性研究[J].环境科学与技术,2015,38(1):6-10,67.

[24]郭焱,张召基,陈少华.好氧反硝化微生物学机理与应用研究进展[J].微生物学通报,2016,43(11):2480-2487.

基金资助:天津市科技计划项目(20YDTPJC01820);

文章来源:杨宗政,孟珠,焦永杰,等.异养硝化-好氧反硝化菌ZH7的分离鉴定及脱氮特性研究[J].生物学杂志,2024,41(05):34-41.