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基于污泥好氧堆肥探究微生物群落结构

2020-02-25 393 上传者：管理员

摘要：通过微生物培养方法，结合高通量测序技术对污泥堆肥物料中的细菌、放线菌和真菌等堆肥过程中常见的微生物进行了全面的分析。结果显示：真菌和细菌的生长在高温期受到限制，与放线菌相比，两者对温度的敏感度较高。污泥堆肥过程中，肥微生物群落中的优势菌菌数同时期呈现规律性变化。为污泥堆肥微生物的分离选育提供理论依据，可作为相关微生物种群结构分析的参考。

关键词：
好氧堆肥
微生物群落
污泥
结构分析
高通量测序
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污泥是污水厂在污水处理过程中必然产生的一种副产物。近年来，随着我国经济的快速发展和城镇污水处理能力的提高，污水处理量逐年增加，污泥产量与日俱增[1]。在污泥处理的诸多方法中，好氧堆肥易于操作且成本较低，符合可持续发展战略，是目前国内外处理污泥的主流技术之一[2]。污泥堆肥过程中，微生物的群落结构千变万化，了解其变化规律，有利于掌握和利用污泥堆肥微生物机理，为堆肥微生物菌群的选育提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 培养基

细菌培养基(牛肉膏蛋白胨):牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L[3]。放线菌培养基(高氏一号):FeSO4•7H2O0.01g，KNO31.0g，K2HPO40.5g，淀粉20.0g，MgSO4•7H2O0.5g，NaCl0.5g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1L。为了抑制样品中细菌和霉菌的生长，使用培养基前，加入体积分数2％的重铬酸钾(100ppm)[3]。真菌培养基(马丁孟加拉红):MgSO4•7H2O0.5g，KH2PO41.0g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，琼脂18.0g，孟加拉红33.3mg，蒸馏水1L。使用前，加入100万单位/L的链霉素，抑制细菌生长[3]。上述培养基pH值均调节至7.0~7.5，均采用121.0℃湿热灭菌20min。

1.2 样品总DNA提取纯化及高通量测序

堆肥样品宏基因组的提取:采用PowerSoilDNA提取试剂盒(MoBioLaboratories，美国)，操作按照试剂盒说明书进行。DNA样品的浓度:采用NanoDropND－2000c(TheromoFisher，美国)进行检测，扩增通用引物[(上游50－GTACTCCTACGGGAGGCAGCAG－30)和(下游50－GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT－30)]，对宏基因组16SrRNAV3－V4片段进行扩增。采用IlluminaMiSeq(PE300)进行测序分析[4]。

2、结果与分析

2.1 细菌、真菌和放线菌

污泥堆肥物料中含有大量的土著微生物类群，细菌、放线菌和真菌是堆肥过程中，几类较常见的微生物，其数量变化受到温度、底物、含水率等多种因素的影响[5，6]。堆肥过程中不同阶段，由于底物组成及堆肥环境的变化，微生物种群结构也会发生变化，有机质的降解是细菌、真菌和放线菌共同作用的结果[7，8]。采用梯度稀释法测定污泥堆肥过程中细菌、真菌和放线菌在不同时间的数量变化，结果见图1。

结果表明，在发酵前3d，细菌、真菌和放线菌数量都急剧升高，最高值分别达到了1010个/g和106个/g(干污泥，以下均是)，之后随着温度进入高温期(超过50℃)，细菌和真菌数量都开始下滑。放线菌在第5d后才开始出现下滑现象，说明细菌和真菌对温度的敏感度要高于放线菌。此外，细菌总数量在降温期有一个再次升高并降低的过程。在堆肥结束阶段，总数量维持在106个/g以上。真菌和放线菌在高温期之后，都出现了稳步增长的过程，一直持续到堆肥结束。

污泥好氧堆肥，利用堆体中好氧微生物，降解堆肥中的各种大分子有机物质，这就需要微生物具有密度和性能的稳定性，才能保证堆肥的顺利进行[9，10]。高温期堆体内仍存在较多微生物，细菌在整个堆肥微生物类群中占有重要地位[11]。整个堆肥进程中，细菌总数和种类始终显著高于放线菌和真菌，且对温度较敏感。由此，细菌在整个堆肥过程中是一个不可忽视的类群。

图1堆肥过程中细菌、真菌和放线菌数量变化

2.2 微生物种群结构

高通量测序共分析6个堆肥样品，其中升温期、高温期和降温期各2个，如图2所示。各个样品间，种属水平具有一定相似性，但在各菌属的丰度上存在较大差异。整个堆肥过程中，共检测到9个可识别的菌属(丰度大于0.5％)，其中Acinetobacter在堆肥的升温期和高温期是优势菌数，随着温度的升高，丰度逐渐下降。在降温期和堆肥结束时，菌属逐渐消失。Chiti-naphagaceae是在高温期过后出现的一个新的优势菌属，堆肥结束时，其丰度达到了20％。Paludibacter只在堆肥的初始阶段出现过，堆肥进入高温期及降温期时就消失了，说明其对温度较为敏感，高温起到了灭活作用。Bacillus在高温期丰度达到了最高，其芽孢具有耐高温的特性，所以对温度不敏感，在高温期可以维持正常的代谢活动。Sphingobacterum和Wautersiella两个菌属，在堆肥的高温期和结束期开始出现，并维持在一个稳定的水平。真菌菌群的多样性变化如图3所示。堆肥过程中，共出现过8个可见菌属(丰度大于0.5％)，其中Puccinia在堆肥的初始阶段和降温期都是优势菌数，只有在高温期丰度减少。由培养方法检测的结果可知，在堆肥的高温期，真菌的生长繁殖严重受限。在此期间，Penicillium在丰度上占据了绝对优势，说明多数真菌对温度较为敏感，在温度高于50℃的环境中难以存活。而Penicillium可以保持一定的活性，随着温度的降低，Puccinia、Mucor等菌属快速繁殖，Penicillium的生长受到了限制，在堆肥结束时几乎消失殆尽。

图2细菌群落在属水平上的分类及各菌属的相对丰度;图3真菌群落在属水平上的分类及各菌属的相对丰度

3、结语

研究发现，整个污泥堆肥过程中，细菌和真菌对温度的敏感度要高于放线菌。细菌总数和种类始终显著高于放线菌和真菌，且对温度较敏感。细菌在整个堆肥过程中是一个不可忽视的类群。高通量测序结果显示，细菌群落中，Acinetobacter是堆肥升温期和高温期的优势菌数，而Chitinaphagaceae是降温期出现的一个新的优势菌属。Bacillus在高温期丰度达到了最高，这与其芽孢的耐高温性直接相关。真菌群落中，Puccinia在堆肥的初始阶段和降温期都是优势菌数，只有在高温期丰度减少。此外，高温期，Penicillium在丰度上占据了绝对的优势，说明了多数真菌对温度较为敏感，在温度高于50℃的环境中难以存活。

参考文献:

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[3]李云蓓.碳源调控对污泥堆肥过程氮素损失的影响及其作用机制[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2014.

[4]马丽红,黄懿梅,李学章,等.牛粪堆肥化中氮素形态与微生物生理群的动态变化和耦合关系[J].农业环境科学学报,2009,28(12):2674-2679.

[5]王国兴.通风量对牛粪堆肥化过程中微生物菌群及氨氧化活性的影响[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2016.

[6]宫晓梅,张磊,孙嘉,等.高温菌剂的添加时间对污泥堆肥指标影响研究[J].环境工程,2013,31(04):114-117.

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张先成,曹旭,李晶,孟利强.污泥好氧堆肥中微生物群落结构分析[J].黑龙江科学,2019,10(8):1-3.

基金项目:国家自然科学青年基金(51708187);黑龙江省科学院科学基金(wsw6840228);黑龙江省科学院杰出青年基金(CXJJ2018SW01)