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在洗脱堆放的多环芳烃土壤环境下探究生物炭对微生物生境的影响

2020-02-25 282 上传者：管理员

摘要：选择较为常见的人工湿地植物、水葱，经过生物炭烧制技术得到秸秆生物炭作为微生物增效试剂，向淋洗池中按土水比1:5(kg/L)加入浓度为0.4g/L的阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，收集机械搅拌30分钟后离心分离后得到的沉淀的土壤，堆放至土壤反应堆中，堆放三十天，经高通量测序后发现洗脱添加了生物炭以后生物多样性亦得以提升。Un-sat/Sat表征微生物细胞膜活性及碳源的跨膜代谢特征，施加生物炭的洗脱土壤中Unsat/Sat变大，高于无添加土壤。由此探明生物炭对经过洗脱的土壤微生物生境的改善作用。

关键词：
土壤洗脱
多环芳烃
微生物群落
生物堆
生物炭
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土壤洗脱技术是一种最常用的化学修复手段，采用分离和洗脱的手段，通过添加水或合适的增效试剂，分离污染土壤组分或使污染物从土壤相转移到液相，从而有效减少土壤的处理量，实现减量化［1］。其中，由于多环芳烃(PAHs)的疏水性，常常使用表面活性剂、环糊精、有机溶剂等，提高污染物在液相中的溶解度及其流动性，实现洗脱的目的［2－4］。但洗脱后的土壤中常会变得贫瘠，微生物生境受到较大的影响，会影响修复后的土壤再次使用。因此，常常考虑往洗脱土壤中添加微生物增效试剂。生物炭是一种经过高温裂解“加工”过的生物质，其富含微孔，不但可以补充土壤的有机物含量，为微生物提供充足的碳源，还可以有效地保存水分和养料，有益于微生物生境的改善。研究指出，生物炭的孔洞结构十分容易聚集营养物质和有益微生物，从而使土壤变得肥沃，更妙的是，它把碳锁定在生物群内，而非让它排放到空气中。同时，生物炭的使用非常绿色环保，很多其他材料都可以制造生物炭，诸如农业产生的大量动植物废料———麦秆、种壳、粪便等;人类制造的垃圾———比如下水污泥或其他生活垃圾等。由此，本研究采用生物炭耦合洗脱后的PAHs污染土壤，利用高通量测序技术，探明生物炭对洗脱堆放的多环芳烃土壤中微生物群落结构与功能的影响。

1、实验部分

1.1 材料和试剂

阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SD-BS):纯度大于98%，日本TokyoKaseiKogyo公司;强力土壤DNA提取试剂盒(PowerSoil○ＲDNAIsola-tionKit):美国MoBio公司。

1.2 生物炭烧制

选择较为常见的人工湿地植物、水葱，经水洗4次去除表面粘附物后风干2天，并在70℃～80℃烘箱中过夜干燥，经粉碎，过0.154mm筛，装于棕色瓶中待用。后称取20g上述生物质粉末于坩埚中，置于350℃的马弗炉中炭化6小时;冷却至室温后取出;炭化物用200mL盐酸(1M)溶液处理12小时，去除灰分;经过滤，用蒸馏水洗至中性后于70℃～80℃烘箱中烘干。

1.3 PAHs土壤洗脱与堆放

向淋洗池中按土水比1:5(kg/L)加入浓度为0.4g/L的阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，机械搅拌30分钟后离心分离，沉淀。收集沉淀的土壤堆放至土壤反应堆中，按照0.1g/g(生物炭/土)的投加比例添加上述烧制的生物炭粉末，每隔1～2周翻动土壤，并保持土壤含水率25%～35%，堆放30天。

1.4 高通量测序

称取0.020g新鲜土壤于DNA提取试剂盒内，提取出来的DNA产物首先用于样品扩增。PCＲ引物采用Miseq测序平台的V3－V4通用引物。采用2X300bp双端测序方法，原始图像数据经basecalling转化为序列数据，获得rawdata或rawreads。得到前期处理完的有效数据后，与NCBI的微生物16S数据库进行BLAST比对。比对后将数据分类，对每个样板库的序列进行OTU注释(相似度≥97%)，使用QI-IME(version1.8.0)工具包进行注释，数据库使用GreenGene(versiongg_13_8)。QIIME(version1.8.0)工具可以对OTU进行物种分类，将序列准确的归类到属(genus)这个级别，进而分析物种丰度、多样性(Shannon指数)以及系统进化。

2、结果与讨论

2.1 细菌菌群生物量与多样性

如图1所示，横坐标为样本编号，纵坐标为门、纲、目、科、属、种六个分类水平各自含有的微生物类群数。“+BC”代表添加了生物炭的洗脱土样，“无添加”代表没有生物炭的洗脱土样。添加了生物炭以后的洗脱土样在生物量上有显著提升。图2进一步显示了添加生物炭以后对土壤Shannon指数的影响，一般而言，Shannon指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度。Shannon指数值越高，表明群落的多样性越高。因此，洗脱添加了生物炭以后生物多样性亦得以提升。

2.2 细菌群落不饱和脂肪酸

不饱和脂肪酸(Unsat)与饱和脂肪酸(Sat)的比值(Unsat/Sat)可以表征微生物群落的跨膜传递特征，例如Li和Zhu［5］在研究Tween80和SDBS对菲专性降解菌Citrobactersp.SA01细胞膜流动性时发现，这两种表面活性剂对细菌的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比例有所影响，促使其比例提升，而这种作用还与表面活性剂的浓度有关。Un-sat/Sat表征微生物细胞膜活性及碳源的跨膜代谢特征［6］，施加生物炭的洗脱土壤中Unsat/Sat变大(图3)，高于无添加土壤3倍。从结果可以看出，本研究中生物炭促进了群落Unsat/Sat的增加，有利于改善群落细胞结构。

图1添加生物炭对群落各分类水平总数的影响;图2添加生物炭对群落生物多样性的影响;图3群落Unsat/Sat值变化

2.3 微生物群落基因(酶)

添加生物炭的有无也会导致土壤微生物群落基因(酶)丰度的差异，如图4所示，原始土壤中含有许多PAHs降解功能基因，诸如cis－1，2－di-hydrodehydro genase和3，4－dioxygenase，但是添加生物炭以后1－hydroxy－2－naphthoate dioxygenase(1H2Nase)和PAH dioxygenase large subunit这两种降解基因(酶)的构成占比增加。说明生物炭的加入对土壤中已有的PAHs降解细菌具有突出的强化作用，因而随着生物炭的加入，1H2Nase和PAH dioxygenase large subunit等作用凸显。

3、结语

如前文所述，生物炭作为一种经过高温裂解“加工”过的生物质，其富含微孔，不但可以补充土壤的有机物含量，为微生物提供充足的碳源，还可以有效地保存水分和养料，有益于微生物生境的改善。而本研究中，洗脱后的土壤在堆放过程中伴随生物炭的加入有利于细菌菌群生物量总数增加，不饱和脂肪酸比例增大，改善群落细胞结构，1－hy-droxy－2－naphthoate dioxygenase和PAHdioxygenase large subunit等基因(酶)的相对丰度增加，PAHs降解细菌功能强化。由此探明生物炭对经过洗脱的土壤微生物生境的改善作用，此对修复土壤的二次使用具有良好的指导意义。

参考文献：

[1]张栋.表面活性剂对PAHs微生物界面行为的影响及调控机制[D].杭州:浙江大学,2013.

郑雄柳,蔡巧兰,温贤勇,殷操,俞河.生物炭对洗脱堆放的多环芳烃土壤中微生物群落结构与功能的影响研究[J].浙江冶金,2019(1):24-26.