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研究人脐带间充质干细胞经不同移植途径治疗肝硬化大鼠模型

2023-12-25 50 上传者：管理员

摘要：目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)制剂(冷冻细胞制剂和新鲜细胞制剂)通过两种给药途径(门静脉/尾静脉)移植对肝硬化模型大鼠的治疗效果。方法 70只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为正常组(n=13，予以普通自来水及普通鼠粮喂养)和肝硬化模型组(n=57，给予CCl4/橄榄油溶液混合液，皮下多点注射造模)。第8周观察两组大鼠的生长状况，取正常组及肝硬化模型组小鼠各3只行组织病理学检查，明确肝硬化形成。选取50只肝硬化模型组大鼠按随机数字表法分为模型组、门静脉(新鲜细胞制剂)组、门静脉(冷冻细胞制剂)组、尾静脉(新鲜细胞制剂)组、尾静脉(冷冻细胞制剂)组，每组10只。分别取新鲜或冷冻hUC-MSC制剂通过门静脉或尾静脉途径移植。给药4周后，比较各组大鼠肝功能指标、肝纤维化程度变化。计量资料两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。结果造模第8周时，肝硬化模型组大鼠肝脏形成多个大小不等的假小叶，符合肝硬化诊断标准，ALT、AST、TBil、ALP水平相较于正常组均明显升高(P值均<0.001)，肝硬化大鼠造模成功。第12周时5组大鼠ALT、AST、TBil、ALP水平比较差异均有统计学意义(F值分别为232.00、177.10、112.30、121.70,P值均<0.001)。进一步两两比较结果显示，模型组ALT、AST、TBil、ALP水平均显著高于正常组(P值均<0.01)；门静脉(新鲜细胞制剂)组、门静脉(冷冻细胞制剂)组、尾静脉(新鲜细胞制剂)组、尾静脉(冷冻细胞制剂)组ALT、AST、TBil、ALP水平均显著低于模型组(P值均<0.01)。结论 hUC-MSC移植4周可改善肝硬化模型大鼠肝功能和肝纤维化程度，细胞制剂的不同、给药途径的不同对治疗结果无明显影响。

关键词：
Sprague-Dawley
大鼠
实验性
弥漫性纤维化
肝硬化
间质干细胞移植
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肝硬化是由多种原因引起的，形态学上表现为弥漫性纤维化、再生结节和肝实质及血管结构的扭曲[1,2]。目前的治疗手段尚无法全面阻止肝硬化进展，终末期阶段行异体肝移植亦受到肝源缺乏、并发症多、排异反应和价格昂贵等诸多因素影响，难以在临床广泛应用，因此亟须开拓更多新的治疗方案[3,4,5]。干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞[6,7]，在特定条件下可诱导分化为肝细胞[8,9,10,11]，为肝硬化的治疗提供了新的选择。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,h UC-MSC）是一种从人类脐带中提取的新型间充质干细胞（MSC），可在体内修复损伤组织和进行免疫调节，还有多向分化潜能，能够改善肝硬化模型大鼠的肝功能指标及病理学改变[12]。本研究将探讨两种不同h UC-MSC制剂（冷冻细胞制剂/新鲜细胞制剂）通过两种给药途径（门静脉/尾静脉）移植对肝硬化大鼠的治疗效果。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

水合氯醛，CCl4（国药集团化学试剂有限公司，国药编码：ZA051842、XW05623502），橄榄油（欧丽薇兰，商品编号：958796),h UC-MSC注射液（浙江泉生生物科技有限公司，批号：QSC1012019101101),40%高脂实验料（上海普路腾生物科技有限公司，货号：PSY1102），北京红星二锅头（北京红星股份有限公司，5 L,56°）。

1.2 实验仪器

ES-300-1包埋机，ES-300-2C冷台（金华市华速科技有限公司），RM2235石蜡切片机（德国莱卡公司），BX-9030A电热鼓风干燥箱（上海柏欣仪器设备厂），DK-8D三温三控水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），Countstar Rigel S2智能一体化荧光分析仪（上海睿钰生物科技有限公司）。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠[生产许可证编号：SCXK（京）2019-0002，使用许可证编号：SYXK（沪）2018-0027],6～8周，220 g左右，由上海交通大学实验动物中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 肝硬化大鼠造模及分组

70只SPF级健康雄性SD大鼠随机分组：正常组13只，予以普通自来水及普通鼠粮喂养；肝硬化模型组57只，给予CCl4/橄榄油溶液（体积比1∶1）混合液3 mL/kg，每周2次，皮下多点注射造模，期间给予高脂饲料和10%乙醇水溶液充当饮用水，以增强CCl4肝脏毒性效应。第8周观察2组大鼠的生长状况，取正常组及模型组小鼠各3只行组织病理学检查，明确肝硬化形成。选取50只肝硬化模型组大鼠，按随机数字表法分为模型组、门静脉（新鲜细胞制剂）组、门静脉（冷冻细胞制剂）组、尾静脉（新鲜细胞制剂）组、尾静脉（冷冻细胞制剂）组，每组10只。采取大鼠眼眶静脉血，检测肝功能指标。

1.4.2 大鼠肝硬化模型h UC-MSC移植

尾静脉移植组：用75%乙醇反复擦拭大鼠尾部，使尾静脉充分显露，注射0.1 mL细胞悬液，脱脂棉球轻轻按压1 min。门静脉移植组：给予大鼠10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，无菌条件下常规消毒、备皮、铺巾，选上腹纵切口，暴露肝脏，于门静脉注入0.1 mL细胞悬液，压迫片刻后关腹；模型组：给予尾静脉注射复方电解质液0.1 mL。

给药方式：尾静脉注射h UC-MSC,2×107个/kg,1次/周，连续4周；门静脉注射h UC-MSC,1×107个/kg，共1次。给药后观察4周[13,14,15]。

1.4.3 常规检查

所有大鼠每周称重一次，记录体质量；观察行为、皮毛和精神状态等，了解大鼠大体状态。

1.4.4 肝功能检测

对模型大鼠实施h UC-MSC移植术后4周（第12周实验结束时），所有大鼠12 h禁食后腹主动脉取血各5 mL,3 500 r/min离心10 min，提取血清。检测ALT、AST、TBil及ALP水平，了解肝脏合成代谢功能，另外观察腹腔有无腹水存在。

1.4.5 组织病理学检查

移植后4周，大鼠脱颈椎处死后打开腹腔取肝组织，PBS清洗血迹后，取2块肝大叶中部约1 cm×1 cm大小肝组织分别置于10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，行HE、Masson和天狼星红染色，观察病理变化；剩余肝组织取材部分，-80℃冻存备用。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 大鼠体质量变化

正常组大鼠体质量一直保持稳定的上升趋势，模型组和给药组大鼠体质量增加趋势低于正常组（图1）。

图1 各组大鼠体质量变化趋势

2.2 第8周大鼠肝功能指标比较

造模第8周，肝硬化模型组大鼠均出现腹水。正常组和肝硬化模型组大鼠ALT、AST、TBil、ALP水平对比差异均有统计学意义（P值均<0.001），且差距较大，符合实验预期（表1）。

2.3第8周大鼠的肝组织病理变化

正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝窦无扩张，肝细胞排列正常，肝细胞正常。肝硬化模型组大鼠肝小叶结构不清晰，被粗细不等的纤维组织包绕，肝细胞排列紊乱，胞浆疏松，细胞变性、坏死，可见炎性细胞浸润，符合肝硬化诊断标准；Masson、天狼星红染色切片光镜下可见肝小叶被粗细不同的纤维组织分隔包绕，形成假小叶（图2）。

2.4 第12周实验结束时大鼠肝功能指标的变化

5组间大鼠ALT、AST、TBil、ALP水平比较差异均有统计学意义（P值均<0.001）（表2、图3）。进一步两两比较结果显示，模型组ALT、AST、TBil、ALP水平均显著高于正常组（P值均<0.01）；门静脉（新鲜细胞制剂）组、门静脉（冷冻细胞制剂）组、尾静脉（新鲜细胞制剂）组、尾静脉（冷冻细胞制剂）组ALT、AST、TBil、ALP水平均显著低于模型组（P值均<0.01）。

2.5 第12周实验结束时大鼠的肝组织病理变化

各组染色结果见图4。光镜下观察HE染色结果：正常组大鼠肝小叶结构清晰，细胞形态正常；模型组大鼠肝细胞结构疏松，发生少许脂肪变，部分细胞变性、坏死，炎症细胞浸润，小叶结构分界不清，形成大小不等的多个假小叶结构；门静脉给药组有较多肝细胞脂肪变性，结构基本恢复，炎症细胞少见；尾静脉给药组与门静脉给药组结果相近，但有较多的脂肪变性。

表1 第8周大鼠肝功能检测结果比较

图2 模型组和正常组的HE、Masson、天狼星红染色结果

Masson染色结果：正常组大鼠几乎未见蓝色纤维化带；模型组大鼠可见明显蓝色纤维化（沉积）条带；门静脉给药组几乎未见蓝色纤维化带，仅有少量浅蓝色的着色部分；尾静脉给药组仍然存在部分蓝色纤维化带。

天狼星红染色结果：正常组肝小叶结构清晰，肝窦无扩张，肝细胞排列正常；模型组可见大量肝小叶被粗细不同的纤维组织分隔包绕，形成假小叶；门静脉（新鲜细胞制剂）组和门静脉（冷冻细胞制剂）组少见假小叶，肝中央静脉之间有纤维间隔相连；尾静脉（新鲜细胞制剂）组和尾静脉（冷冻细胞制剂）组的纤维组织较粗和数量较多，假小叶稍明显。

3、讨论

目前，临床尚无肝硬化的根治方法，仅通过病因治疗、抗纤维化延缓疾病进展[16,17]。在长期以来的研究中，MSC成为肝硬化或肝纤维化治疗的关注热点。首先从骨髓MSC治疗肝硬化探索[18]，后续人脐带MSC[19,20,21]、脂肪MSC等[22,23,24]治疗肝硬化的研究相继出现，且研究结果积极。既往研究[25]通过大鼠实验尝试采用尾静脉、门静脉和肝动脉移植骨髓MSC治疗肝硬化，结果显示不同途径移植治疗效果无显著差异。而hUC-MSC不仅具有MSC的共性，而且具有更稳定的生物学特性，相对容易获得，来源丰富，抗原性低，不存在伦理问题，是治疗肝纤维化和肝硬化的良好选择，同种异体来源的MSC注射液使用是安全的[26]。

表2 第12周大鼠肝功能检测结果比较

图3 第12周终点各组肝功能指标结果比较

图4 第12周终点各组染色结果（×100)

MSC移植途径的选择，可能直接影响移植细胞在肝脏内的定植[27],Huang等[28]研究结果表明局部给药（注入靶组织可提高归巢效率）后，定植在肝脏的干细胞数量会比全身给药多；与静脉注射MSC相比，并未产生更好的结果，这可能与组织和炎症状态有关[29,30]；以往研究及本研究结果表明，局部或全身给药，治疗效果无显著差异。另外有关资料[31]显示：新鲜分离的MSC具有较强的归巢效率和组织修复作用，而临床试验中使用的MSC通常是低温保存的，这损害了MSC的归巢能力，缩短了其在体内和组织修复的耐久性。有文献[32]报道：新鲜培养的和低温保存的骨髓MSC在临床前的体内原代效力和体外传代效力结果之间没有显著差异。局部和全身给药的干预效果相近；冰冻保存后对干细胞归巢和修复作用有一定影响，但是疗效和新鲜细胞制剂相比无明显差异。所以从使用的方便性、安全性与简繁程度来看，静脉给予冷冻制剂是符合临床应用需要的，也可能是未来干细胞制剂的主要类型之一。

h UC-MSC治疗肝硬化的可能机制主要基于细胞的旁分泌作用、转分化能力[33]和免疫调节功能[34]。其中报道较多是通过TGF-β1/Smad类似信号通路以旁分泌方式发挥抗纤维化功能[35,36]，抑制TGFβ1/Smad信号通路的激活，起到抗纤维化作用。

综上，hUC-MSC移植是一种有效的治疗肝硬化的方法。经外周静脉途径移植或门静脉注射移植（冷冻细胞制剂和新鲜细胞制剂）均可有效改善肝硬化，且两种移植途径和两种细胞制剂治疗效果无明显差异。但结合实际临床操作的难易程度及治疗费用等问题，更倾向于选择外周静脉途径移植冷冻细胞制剂。随着未来更多深入的研究，hUC-MSC有望在肝硬化的治疗方面发挥更大作用，成为肝硬化治愈的希望所在，并为以后临床应用提供参考和依据。

伦理学声明：本研究方案于2018年11月12日经由上海交通大学实验动物伦理委员会审批，批号：20181112，符合实验室动物管理与使用准则。

参考文献:

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[16]刁睿,陈治梁,吕永双,等.恩替卡韦联合三联疗法治疗乙肝肝硬化脾功能亢进伴食管静脉曲张破裂出血效果研究[J].创伤与急危重病医学, 2022, 10(3):210-212.

[34]刘明,汪劲松,刘沐芸,等.人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究[J].中华医学杂志, 2015, 95(32):2630-2633.

基金资助:国家卫健委干细胞临床研究项目(MR-46-21-014648)~~;

文章来源:邱英麒,王宏伟,朱宏岩等.人脐带间充质干细胞经不同移植途径治疗肝硬化大鼠模型的效果比较[J].临床肝胆病杂志,2023,39(12):2851-2857.