颗粒细胞起源于卵巢网和卵巢表面上皮，与卵母细胞关系密切，并且两者都是卵泡的重要组成部分。颗粒细胞发育自原始卵泡开始，每个原始卵泡周围都有一层扁平颗粒细胞围绕。女性青春期后，随着原始卵泡激活形成初级卵泡，扁平颗粒细胞分化为单层立方颗粒细胞，并进一步分化成层状颗粒细胞包绕卵母细胞形成次级卵泡，最终发育形成窦状卵泡。颗粒细胞在窦状卵泡阶段分化形成壁层颗粒细胞（mural granulosa cells,MGs）和卵丘颗粒细胞（cumulus granulosa cells,CGs）。MGs位于卵泡壁上，主要参与信号转导和细胞分化，而CGs主要参与细胞的增殖和代谢过程。CGs与卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合物（cumulus-oocyte complex,COC），复合物内CGs与卵母细胞通过间隙连接进行物质交换和信号分子传递，并影响卵母细胞的发育、排卵以及卵子受精的过程。因此，CGs与卵母细胞之间的作用机制有助于人们对生殖细胞发育机制有进一步的认识。

1、卵丘颗粒细胞影响卵母细胞发育

1.1 CGs为卵母细胞发育提供能量物质

CGs提供卵母细胞发育过程所需的大部分能量物质，并且CGs能够减少不利因素对卵母细胞的刺激，影响卵母细胞正常发育。因此，功能正常的颗粒细胞对卵母细胞的生长、代谢具有重要作用。卵母细胞处在没有血管存在的微环境中，需要颗粒细胞与卵母细胞之间通过间隙连接完成信息传递及营养物质交换[1]。细胞发育过程中离不开能量，而能量大多是细胞利用葡萄糖通过三羧酸循环产生。研究发现：随着卵母细胞的发育过程的进展，其所需要的葡萄糖数量也随之增加[2]，这表明卵母细胞在发育的过程中需要巨大的能量。但卵母细胞缺乏磷酸果糖激酶导致本身利用葡萄糖产生能量的能力较差。另外，葡萄糖的亲水的特性导致其通过扩散跨膜进入细胞的能力较差，所以需要含有较多葡萄糖转运蛋白的CGs将葡萄糖摄取至细胞内，并通过糖酵解途径将葡萄糖转化成丙酮酸，随后丙酮酸在卵母细胞内通过氧化磷酸化途径产生能量满足卵母细胞生长发育需求。ZHANG等[3]将小鼠卵巢颗粒细胞在不含丙酮酸的培养基中培养，发现颗粒细胞中糖酵解相关蛋白表达增加，并通过mTOR-KITL途径增加了糖酵解产生的丙酮酸数量，这进一步印证了葡萄糖需要通过CGs进行转化形成丙酮酸后才能供给卵母细胞使用的结论。

脂肪酸是除葡萄糖外卵母细胞生长发育的又一能量来源，由于卵母细胞内缺乏脂肪酸合成相关的酶[4]和相关膜转运受体[5]，所以需要在颗粒细胞中合成并累积一定量的脂肪酸，并传递到卵母细胞供其利用。在成熟卵母细胞的CGs中有关脂质合成的蛋白高度表达，并且CGs内的脂质浓度随着卵母细胞发育过程的进展而下降[6]，通过放射物质追踪发现去除颗粒细胞的卵母细胞内脂质含量比含有颗粒细胞的卵母细胞内脂质含量低[7]，进一步印证颗粒细胞对于卵母细胞脂质代谢过程的重要性。也有观点认为CGs可以保护卵母细胞在成熟过程中免受过量脂肪酸的损害，这可能与CGs表达促进硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase 1,SCD1）有关。SCD1通过促进饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸的转化，减少饱和脂肪酸对卵母细胞的损伤[8]。所以，CGs还能通过保护卵母细胞免受饱和脂肪酸产生的细胞毒性来保证卵泡的正常发育。

1.2 CGs参与卵母细胞的减数分裂过程

CGs通过向卵母细胞提供众多细胞因子以调节其减数分裂的过程。三磷酸腺苷、环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,cAMP）、环磷酸鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）等物质不仅为卵母细胞提供发育所需的能量，还作为信号因子参与卵母细胞的减数分裂进程。

CGs上的利钠肽受体结合C型利钠肽后生成cGMP,cGMP进入卵母细胞后使得磷酸二酯酶（cAMP-phosphodiesterase,c AMP-PDE）失活，导致cAMP的分解代谢过程受到抑制，从而激活蛋白激酶A (protein kinase A,PKA）。PKA可引起周期蛋白依赖性激酶1活性降低，并抑制卵母细胞成熟促进因子（maturation-promoting factor,MPF）活性，从而使得卵母细胞停滞在第一次减数分裂状态[9]。

雌激素的正反馈作用导致LH峰的出现，引起CGs上的利钠肽受体去磷酸化，使得c GMP的生成减少[9]。同时LH激活CGs内MAPK3/1信号通路，导致间隙连接蛋白活性降低，进入卵母细胞的c GMP水平下降[10]。cGMP的水平下降导致c AMP-PDE被激活，引起卵母细胞内cAMP浓度降低并激活MPF，从而诱导减数分裂的恢复以及卵丘的扩张，为排卵和受精做准备[11]。YAMOCHI等[12]在不添加颗粒细胞的培养基中发现部分卵母细胞自发的恢复减数分裂，而添加颗粒细胞的培养基中卵母细胞减数分裂完全阻滞，进而证明颗粒细胞在卵母细胞减数分裂过程中起着重要的调节作用。

在对猪卵母细胞-卵丘细胞复合物的体外发育研究中，研究人员将发现，在缺乏生长分化因子的条件下，复合物无法形成窦状结构，同时，骨形态发生蛋白15以剂量依赖的方式促进窦样结构的形成[13]。此外，由于卵母细胞不能产生葡萄糖作为能量底物，源自未分化颗粒细胞的绒毛细胞将葡萄糖代谢为丙酮酸盐，并将能量输送给卵母细胞进行成熟。卵母细胞衍生的BMP-15和GDF-9参与调节胆固醇的糖酵解和合成，因为颗粒细胞通过间隙连接为卵母细胞提供丙酮酸、乳酸盐和胆固醇生物合成途径产生的产物的营养[14]。

2、卵丘颗粒细胞影响卵母细胞成熟和排卵

2.1 卵丘扩张影响卵母细胞成熟、排卵

卵丘扩张是CGs在LH峰的作用下分泌的糖蛋白和蛋白聚糖形成细胞外基质（extracellular matrixc,ECM）的过程。CGs的增殖与扩张是排卵前颗粒细胞特有的分化特征，在卵母细胞成熟和排卵过程中起着重要作用。在此过程中，CGs分泌表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF)[15]、前列腺素[12]、趋化性细胞因子[16]，从而激活卵丘扩张。对于猪胚胎体外成熟（in vitro maturation,IVM）相关的研究发现，趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2）诱导人内皮细胞中MAPKs-ERK和p38的激活[17]。在MAPK途径中，CCL2激活猪腔上皮细胞中的p-ERK1/2[18]。IVM期间补充CCL2增加了ERK1的表达水平和ERK1/2的磷酸化水平，从而提高卵母细胞减数分裂成熟和卵丘扩张因子的表达，包括正五聚蛋白3(pentraxin3,PTX3）和CD44，有助于卵丘扩张[16]。在对水牛卵母细胞IVM的研究发现，成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10,FGF10）显著提高了细胞核成熟率，提高了MPF的活性，促进了水牛卵母细胞的成熟。此外，FGF10还显著抑制卵丘细胞的凋亡，同时促进其增殖和扩张，增加了卵丘细胞对葡萄糖的吸收[19]。

EGF在LH的作用下与CGs表达的EGFR结合，激活ERK1/2通路，进而增强透明质酸合酶2(hyaluronan synthase 2,HAS2）在CGs的表达[20]，并促进透明质酸（hyaluronic acid,HA）生成[21]。而HA的分泌使CGs扩张，并将颗粒细胞包裹形成ECM。HA作为构成ECM的结构的重要部分在排卵过程中发挥重要作用，一方面，HA与CGs上表达的CD44蛋白肽链的N端结合，参与卵丘扩张过程。研究表明CD44 mRNA的转录水平与卵丘扩张的程度呈正相关，CD44与HA结合后导致间隙连接蛋白失活，卵母细胞减数分裂恢复，并促进其成熟和排卵[22]。另一方面，HA与CGs分泌的HA结合蛋白（α-胰蛋白酶间抑制剂（inter-alpha-trypsin inhibitor,IαI）、肿瘤坏死因子-α诱导蛋白6 (tumor necrosis factor-alpha-induced protein 6,TNFAIP6）和PTX3结合后会阻碍ECM的生成以及卵丘扩张的进程。有研究发现敲除TNFAIP6、PTX3基因的小鼠CGs产生的HA无法锚定在CGs上，导致卵丘扩张异常[23]，影响卵母细胞成熟和排卵。缺乏IαI基因小鼠的CGs无法形成稳定的卵丘ECM，影响卵丘扩张，并且IαI与HA结合过程受到破坏会导致排卵水平下降[24]。因此，ECM中的任何一种组成物质的改变都会影响其结构的完整性并阻止排卵，这表明卵丘扩张通过ECM的生成影响排卵过程。另外，最近在一项对排卵相关基因进行转录组RNA测序的研究中鉴定出长链非编码RNA透明质酸合酶2反义RNA 1(HAS2Antisense RNA 1,HAS2-AS1）与排卵过程相关，并在成熟的颗粒细胞中发现HAS2-AS1表达丰富，该基因正向调节HAS2的表达，促进卵丘细胞的扩张，利于卵母细胞成熟和排卵[25]。XIANG等[26]研究发现HAS2-AS1在多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）患者中会过表达，导致启动子区域的甲基化程度增强，引起TGFβ受体2的表达水平降低，并且TGFβ信号传递与卵丘扩张相关[27]。这表明PCOS患者排卵障碍可能与卵巢颗粒细胞HAS2-AS1过表达引起TGFβ信号传导受阻导致卵丘扩张异常有关，进一步证实卵丘扩张在卵母细胞成熟和排卵过程中的重要性。

在卵丘扩张过程中，还需要卵母细胞分泌因子来增加HAS2、前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS2）、PTX3和TNFAIP6转录物。这些转录物是卵丘扩展所必需的，因为PTGS2、PTX3或TNFAIP6基因的无效突变表型或HAS2活性的抑制严重损害了卵丘扩展[28]。在LH峰过后，CGs上表达的PTGS2的水平升高，并促进前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2）的产生，PGE2受体结合后对诱导排卵有重要意义。非甾体消炎药（如吲哚美辛）可以降低PGE2受体活性，抑制卵泡破裂，导致卵母细胞发育异常、排卵进程延迟或不排卵。细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EV）能够促进卵丘扩张，影响卵母细胞成熟和排卵过程，机制可能是EV能够增强CGs中PTGS2mRNA的转录水平，但具体通过何种信号途径发挥作用还未可知，需进一步研究验证。

此外，卵泡刺激素（follicle stimulation hormone,FSH）诱导猪、牛和人的双向调节素和表皮调节素表达，并刺激卵丘扩张。FSH诱导扩张的机制是通过CCs中cAMP浓度的增加和HAS2基因表达的增加来实现的。FSH刺激卵丘扩张相关性，在ECM中积累糖胺聚糖。在猪中，胰岛素样生长因子1的作用，一种已知的PI3K/AKT信号激活剂，通过PI3K/AKT和MAPK3/1依赖性机制，激活FSH刺激的扩增ECM内HA的合成[29]。PI3K/AKT的活性对于促性腺激素诱导的体外CC扩增至关重要。CCs中HAS2和PTGS2的表达受到FSH激活和PKA非依赖性途径的调节。卵丘扩张的改变是繁殖不利的原因，无论是直接原因还是卵母细胞功能和结构质量下降的反映，因此它可能会破坏性地影响COC排卵过程的运动。

2.2 细胞间的通讯连接对卵母细胞成熟与排卵的影响

卵母细胞成熟与排卵需要颗粒细胞和卵母细胞之间的间隙连接进行调节，间隙连接中断会导致卵母细胞发育成熟迟缓，无法完成排卵过程，ZHOU等[30]发现在体内的成熟过程中的卵母细胞与CGs间隙连接断开后，第一极体未能排出，从而导致卵母细胞成熟及排卵障碍。卵母细胞成熟、排卵相关的间隙连接蛋白主要包括连接蛋白43(Connexin43,Cx43）和连接蛋白37 (Connexin37,Cx37）。Cx37是CGs与卵母细胞之间的连接蛋白，在各个阶段的CGs和卵母细胞中均有表达。在小鼠中，CX37缺乏会导致卵母细胞发育迟缓甚至停滞，最终无法排卵。目前还没有研究证明Cx43能够在CGs调节卵母细胞成熟、排卵过程中直接发挥作用。但Cx43的缺乏会导致颗粒细胞间信号传递障碍，可能影响CGs在卵母细胞成熟及排卵过程中的作用。Cx43基因敲除的小鼠表现为颗粒细胞发育异常，导致卵泡停留在初级阶段，引起卵母细胞发育成熟障碍。有研究发现在PCOS患者的卵母细胞中Cx43基因表达水平较正常女性卵母细胞低[31]，而大部分PCOS患者存在排卵障碍，说明Cx43的表达可能与卵母细胞排卵相关，但具体的机制并不明确，需进一步的研究探索。

间隙连接将营养物质和小分子，如离子、代谢产物、氨基酸和细胞内信号分子，通过CC从GC传递到卵母细胞。在GC中，cGMP在排卵前阶段维持TZP。排卵时，LH与颗粒细胞中的黄体生成素受体结合，并触发EGFR配体的释放，从而激活ERK/MAPK，并导致肌动蛋白细胞骨架重组和间隙连接消失。据报道，在小鼠中，间隙连接对于卵母细胞的体内和体外成熟是必要的，受精过程中CC的存在改善了受精和随后的胚泡形成，这种改善是由间隙连接调节的[32]。在卵母细胞减数分裂恢复过程中，LH激增降低了卵母细胞中的cAMP水平。LH激增导致活性CD44，其参与间隙连接蛋白的磷酸化，CC和卵母细胞之间间隙连接的破裂导致cAMP转移到卵母细胞的减少，从而触发减数分裂成熟。

3、卵丘颗粒细胞参与卵母细胞受精过程

体外受精相关研究发现，相较于去除了卵丘细胞的裸露卵母细胞，被卵丘细胞包围的卵母细胞受精率和发育能力都更高，说明卵丘细胞对于卵母细胞的受精和发育至关重要。牛的体外受精研究发现，牛卵丘细胞的分泌物以及通过代谢变化减少氧化应激可以增强精子的受精能力。通过对接受卵浆内精子注射体外受精患者卵母细胞中的卵丘细胞研究发现，血红蛋白可能保护卵丘细胞免受氧化应激诱导导致的细胞凋亡，这可能增强卵丘-卵母细胞的相互作用。此外，卵丘细胞衍生的血红蛋白可以转移到卵母细胞，并保护其免受体内和体外发生的氧化应激的不利影响，从而提高受精率[33]。

在排卵后CGs仍然与卵母细胞保持密切联系。在精卵结合过程中，精子首先需要穿过CGs和透明带，精子顶体表达的垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP）与CGs中表达PACAP1型受体（PAC1Receptor,PAC1R）结合，诱导发生顶体反应[34]，释放顶体溶解酶，有利于精子穿过透明带与卵子结合形成受精卵。CGs分泌的金属蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif,Adamts）是一种细胞外金属蛋白酶，在卵母细胞受精过程中发挥重要作用。Adamts-1与底物多功能蛋白聚糖（versican,VCAN）结合后在诱导卵母细胞排卵、受精过程发挥重要作用，敲除Adamts-1基因的小鼠卵母细胞形态发生异常，受精率显著降低，胚胎发育不良的概率增加，说明CGs表达的Adamts-1与卵母细胞受精能力有关。在排卵前，Adamts-4、Adamts-5和VCAN由发育中的卵母细胞周围的GCs共同表达，并在卵母细胞生长的早期阶段和排卵过程中发挥不可或缺的作用[35]。在PCOS患者的CGs中发现Adamts-4和Adamts-5表达水平显著降低，可能是与PCOS患者卵母细胞质量差，受精率低有关[36]。Li等[37]研究发现在卵巢中表达的丝氨酸蛋白酶35(Protease Serine 35,PRSS35）与卵母细胞受精能力相关，并且受精后的CGs中PRSS35的m RNA水平显著升高，还有研究发现与单纯的卵母细胞培养相比，培养基中添加CGs的卵母细胞受精率明显升高，这都进一步说明CGs在受精过程中的重要性和必要性，同时该研究还发现CGs可以保护卵母细胞免受精子在获能时产生ROS造成的细胞损伤[38]，考虑可能是CGs分泌因子起了抗氧化损伤的作用，但具体因子及相关机制并不明确，需进一步研究阐述具体机制。

4、展望

CGs不仅为卵母细胞的发育提供能量支持，而且在卵母细胞的成熟过程中分泌相关因子和蛋白促进卵母细胞的发育、成熟过程。即使在完成排卵的卵母细胞中，CGs仍发挥一定作用来协助成熟的卵子完成受精过程。近年来的研究已经对CGs的功能以及CGs在卵母细胞成熟及排卵过程中的作用有了更深层次的了解，但仍有一些问题亟需解决，如：CGs评估卵母细胞质量及胚胎发育潜能的可行性及机制；CGs如何保护卵母细胞免受精子获能过程中产生ROS的影响；lncRNA（如HAS2-AS1）能否评估卵母细胞质量以及妊娠结局。此外，目前的CGs与卵母细胞的相关研究大多依靠细胞实验和动物模型实验，结合临床疾病（如PCOS、卵巢早衰等）的研究相对较少。未来研究需更多与临床疾病相结合来探究CGs与卵母细胞间的作用，从而为临床评估卵母细胞质量及相关疾病的治疗提供参考依据。

基金资助:山东潍坊市卫生健康委员会科研计划项目(wfwsjk2019029);

文章来源:吴晓东,孙理兰,马华刚.卵丘颗粒细胞在卵母细胞发育､成熟和受精中的作用[J].中国临床医生杂志,2023,51(12):1408-1412.