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小鼠棕色脂肪透射电子显微镜样品固定方法的改良

2023-12-25 69 上传者：管理员

摘要：目的改良小鼠棕色脂肪组织透射电子显微镜样品固定方法，以获得更好的线粒体和脂滴的超微结构。方法对小鼠棕色脂肪组织的固定方法进行优化，主要包括将前固定剂中多聚甲醛的浓度从2%提高到4%;将后固定剂四氧化锇的缓冲液换成咪唑缓冲液；同时采用心脏灌注和浸泡结合的固定方式。比较两种方法制备的细胞超微结构(每组3只小鼠);并将改良后的方法应用于线粒体和脂滴的定量分析实验。结果与改良前相比，用改良后的方法制备的棕色脂肪细胞的线粒体嵴及其他膜性细胞器的结构更完整；脂滴呈现为高电子密度的圆形结构。用该方法观察到了冷适应后棕色脂肪细胞线粒体嵴密度升高和脂滴增多现象。结论改良后的方法能更好地保存棕色脂肪细胞中的细胞器特别是线粒体和脂滴的超微结构，可应用于研究该类型细胞在不同生理或病理条件下发生的超微结构变化。

关键词：
固定方法
小鼠
棕色脂肪细胞
线粒体
组织学
脂滴
超微结构
透射电子显微术
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棕色脂肪细胞富含线粒体和分散的小脂滴，能通过非颤抖产热消耗脂肪酸和葡萄糖[1,2]。在寒冷暴露时，该细胞中的线粒体数量增多，线粒体嵴密度增加，同时脂滴周转增加[3,4,5,6]。在超微结构水平观察线粒体和脂滴的形态和分布是评价棕色脂肪代谢状态的重要指标。然而，我们发现，用目前常规的透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)固定方法制备的棕色脂肪细胞的超微结构保存不够好，线粒体嵴不清晰，脂滴呈现空泡样，无法满足研究需要。为此，我们对固定方法进行了系列改良，主要包括将前固定剂中多聚甲醛的浓度从原来的2%提高到4%;将后固定剂锇酸的缓冲液由原来的缓冲PB更换成咪唑缓冲液；同时采用心脏灌注与浸泡相结合的固定方法。用改良的方法获得了保存良好的线粒体和脂滴超微结构，并成功观察到了棕色脂肪细胞的线粒体嵴和脂滴在冷刺激条件下发生的适应性变化，为后续研究棕色脂肪的结构和功能调控打下基础。

一、材料和方法

1. 主要试剂

多聚甲醛(Sigma公司，P6148)、戊二醛(国药集团药业股份有限公司，A600875)、咪唑(上海生工生物工程技术服务有限公司，A500529)、锇酸(Ted Pella公司，18456)、Epon 812包埋剂(SPI公司，02660-AB)等。

2. 实验动物

实验室自行繁殖SPF级C57/B6小鼠，种鼠来源于南京大学-南京生物医药研究院(编号：#J000664), 动物生产许可证：SYXK(沪)2017-0004。小鼠在动物房繁殖和饲养，给予普通标准饮食，饲养温度24℃,12 h光照/12 h黑暗昼夜循环。在小鼠 2月龄时，将其转入冷光源恒温光照培养箱(宁波江南仪器厂，DGXM-508A)饲养，利用该培养箱将饲养的环境温度精确控制在30℃。小鼠在30℃饲养 1月后将饲养箱的温度通过梯度降温的方法降至4℃进行寒冷诱导，并在4℃饲养49 h。所有实验动物操作均符合海军军医大学实验动物操作指南要求。

3. 组织学分析

小鼠麻醉后分离肩胛骨间的棕色脂肪组织，4%多聚甲醛4℃固定过夜。然后用常规方法进行乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋。组织切片经HE染色后在普通光学显微镜下观察。

4. 改良前的电镜样品固定方法

4.1 固定剂配置：

前固定剂为含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合液；后固定剂为1%四氧化锇，均用0.1 mol/L PB配置。

4.2 样品处理：

小鼠麻醉后分离肩胛骨间棕色脂肪组织(去除周围白色脂肪组织),将组织切成1 mm×1 mm×1 mm小块后转移到装满前固定剂的离心管中，在摇床上360°持续旋转4℃固定过夜；样品经0.1 mol/L PB 彻底漂洗后用后固定剂室温固定2 h。

5. 改良后的电子显微镜样品固定方法

5.1 试剂配置：

(1)灌注液配制：125 ml PBS中加0.625 g NaNO2,200 μl 肝素(6.25×106 IU/L),肝素具有抗凝作用，NaNO2具有扩血管作用。(2)前固定剂为含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合液(用0.1 mol/L PB配置);后固定剂为用咪唑缓冲液配置的的2%四氧化锇，配置方法：4%四氧化锇∶0.2 mol/L PB∶0.2 mol/L咪唑=3∶2∶1,pH 7.5[7]。

5.2 灌注固定：

小鼠麻醉后，剪开右心耳，迅速从左心室灌入37℃预温的灌注用PBS,灌注压力以达到肝脏适度充盈为标准，将血液快速冲出(大约需要10 ml PBS, 限定30 s内完成),然后立刻用10 ml预冷的前固定剂心脏灌注固定，整个灌注在2 min内完成。灌注固定后分离棕色脂肪组织，按上述常规方法将样品放在改良后的前固定剂中室温浸泡固定2 h; 然后在改良后的后固定剂中室温固定1 h。

6. 固定后样品处理

按常规方法进行梯度乙醇和丙酮脱水、包埋剂浸透和包埋。超薄切片厚度70 nm, 每份样品切3个组织块。改良前的方法切片需经常规铅铀染色，改良后的方法切片不需铀和铅染色直接在TEM(日立，H7650)下观察。

7. 线粒体嵴的量化方法

放大3000倍和5000倍的TEM照片可用于线粒体嵴量化分析，用软件Image J(V 1.53k)软件测出线粒体的截面积和嵴的长度之和，嵴密度的计算公式为：嵴密度=嵴长度和/线粒体截面积。每份样品观察3块组织，每块组织的切片观察3～6个细胞，只统计边界和所有嵴膜都清晰的线粒体。热中性组和冷处理组之间统计学比较采用独立样本Student t检验(t-test),数据采用均值±标准误呈现。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

8. 脂滴的量化方法

低倍成像(300倍)的TEM图片用于脂滴量化分析，用Image J V1.53 K软件测出图片的面积，用多点工具(multi-point tool)测图片内的脂滴数(每张图片大约7～10个细胞截面),算出每1000 μm2面积内脂滴数。每份样品观察3块组织，每块组织统计 1～2 张图片。热中性组和冷处理组之间统计学比较采用独立样本Student t检验(t-test),数据采用呈现。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

二、结果和讨论

成年小鼠肩胛骨间的棕色脂肪组织在大体上呈现棕色，与周围的白色脂肪组织很容易区分(图1A),光学显微镜下可见经HE染色的棕色脂肪细胞中富含大量空泡样的脂滴结构(图1B)。

图1 小鼠肩胛骨间棕色脂肪组织的大体和光学显微镜下的形态

图2 改良的固定方法使得小鼠棕色脂肪细胞的超微结构得到更好的保存

我们首先采用常规的多聚甲醛和戊二醛混合前固定液以及PB配制的锇酸后固定液对棕色脂肪组织进行浸泡固定，发现用该常规固定方法制备的棕色脂肪细胞的超微结构保存不够好，表现为线粒体外膜结构不清，线粒体嵴存在自溶现象，脂滴呈现为电子密度很浅的空泡样结构(图2A～2C),这些结果提示，常规的固定方法不能很好地保存棕色脂肪细胞的膜性细胞器结构和脂滴。

图3 改良后的方法适用于研究小鼠棕色脂肪细胞在冷训练下发生的超微结构重塑

为了能获得高质量的小鼠棕色脂肪细胞的超微结构图像，我们对固定方法进行了系列优化。用改良后的方法制备的棕色脂肪细胞的超微结构得到了很大的改善，细胞在未经铀和铅染色情况下呈现很好的反差。细胞中富含大量结构完整的线粒体而且线粒体的嵴密度很高，同时具有大量大小不等的脂滴，这些都是棕色脂肪细胞最显著的超微结构特征(图2D～2F)。脂滴呈现为具有较高电子密度的圆形结构(图2D～2E)。

为了进一步验证改良后的方法的适用性，我们用该方法对棕色脂肪细胞在寒冷诱导过程中的超微结构变化特征进行了观察。我们发现，将小鼠从热中性(30℃)环境转至4℃冷适应49 h后，棕色脂肪细胞中的脂滴形态由“大脂滴”转变成更多的“小脂滴”的形态(图3A,3B,3D,3E);定量分析结果显示，单位面积内脂滴数量显著升高(图3G);同时，线粒体嵴的密度也明显增加(图3C,3F,3H),提示寒冷刺激诱发棕色脂肪细胞产生超微结构“重塑”现象。

改良后的固定方法利用了灌注固定的快速和均匀的优点，提高了固定效果。在灌注固定中需要对灌注压力和时间进行控制。灌注压力合适时，肝脏能维持在正常大小，如果肝脏明显膨大提示灌注压力过高。灌注PBS这段时间组织已经处于缺血缺氧状态，所以要严格限制时间，以最短的时间(30 s)将大部分血液冲出体外然后立即灌入前固定剂。我们选择4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合液作为前固定剂，利用多聚甲醛渗透速度快和戊二醛更强的交联特性，使得细胞的细微结构得到更好的保存。

改良后的后固定剂中锇酸的浓度提高了1倍，并用咪唑作为缓冲液成分。锇酸是一种强氧化剂，能与蛋白质形成交联而稳定蛋白质，更重要的是它能与不饱和脂肪酸链结合形成复合物，是唯一能固定脂类的固定剂[8,9]。但是，用常规的缓冲液配置的锇酸对脂质的固定效果不够好，脂滴中的脂质成分容易在后续的脱水环节被抽提掉而使得脂滴呈现空泡化。咪唑能显著增强锇酸与不饱和脂肪酸如亚麻酸的相互结合，使得脂滴和生物膜等结构能够结合更多的锇酸，这样能更好地保存这些细微结构[7]。同时，由于这些超微结构结合了更多的高电子密度的金属锇，使得其在电子显微镜下的反差增大。所以，本研究在没有用铀和铅双染的情况下，能观察到反差很强的线粒体和其他膜性细胞器以及电子密度很高的脂滴结构。但如果需要观察细胞核等结构，可以用醋酸铀染色以增强反差。

改良后的固定方法能很好地保存棕色脂肪细胞中的线粒体等膜性细胞器以及脂滴结构，因此，可以用于研究不同生理或病理条件下该细胞发生的超微结构变化。本研究中应用改良后的方法成功观察到了寒冷诱导后线粒体嵴密度增加，以及脂滴大小和数目的改变等超微结构“重塑”现象，图片质量可满足超微结构分析的定性和定量需求。此外，该方法还可应用到研究棕色脂肪细胞在代谢稳态失衡等病理条件下发生的可能的超微结构变化(如棕色脂肪白色化)。我们推测该方法还适用于研究其他富含线粒体和脂质成分的细胞，如肝细胞等。对于线粒体和脂质成分含量较少的细胞类型，这种方法是否具有优势，还有待进一步实验验证。

参考文献:

[2]郭冰冰,王炳蔚,苏志洁,等.醉茄素A通过诱导白色脂肪组织褐变抵御高脂饮食诱导的肥胖 [J].解剖学报,2020,51(4):570-575.

基金资助:国家自然科学基金青年基金(32100929);

文章来源:魏纯纯,王平,林方兴等.小鼠棕色脂肪透射电子显微镜样品固定方法的改良[J].解剖学报,2023,54(06):738-742.