腰痛是肌肉骨骼脊柱疾病最典型的症状，也是导致残疾的主要原因[1]，而椎间盘退行性病变是引起慢性腰痛的主要原因之一。目前关于椎间盘退行性病变的分子机制尚未阐明。研究表明，椎间盘髓核细胞的凋亡、氧化应激和炎症反应在椎间盘退行性病变发挥了重要作用[2,3,4]。退行性炎症级联反应通常是由椎间盘中分解代谢和合成代谢过程之间的不平衡引发的[5]。在腰椎间盘退变发育过程中，白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β）等炎症因子不断积累，破坏髓核细胞稳态，促进活性氧（reactive oxygen species,ROS）的积累，诱导氧化应激，导致髓核细胞过度凋亡，加速细胞外基质降解，从而恶化椎间盘的内部微环境[6,7]。

G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor,GPR30）是介导雌激素功能的一种经典的膜受体[8]，而雌激素减少与椎间盘退行性病变显著相关[9]。然而，GPR30在人类脊柱中的表达和功能知之甚少。研究发现，GPR30在多种疾病中能减轻氧化应激损伤和炎症反应[10,11]，并且还可以通过促进炎症消退改善关节炎[12]。但GPR30是否能通过抗炎和抗氧化应激影响椎间盘退行性病变尚未见报道。本研究采用IL-1β处理大鼠椎间盘髓核细胞，复制椎间盘退变体外模型，探究GPR30对椎间盘退行性病变的作用及其分子机制。

1、材料与方法

1.1细胞来源和主要试剂

大鼠椎间盘髓核细胞购自上海康朗生物科技有限公司。DMEM/F12培养基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、谷氨酰胺、青霉素和链霉素均购自美国GIBCO公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，Lipofectamine 2000转染试剂购自德国Sigma-Aldrich公司，IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒购自美国R&D公司，ROS、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒均购自上海酶联生物公司，Prime Script™RT预混液购自日本Ta Ka Ra Bio公司，抗GPR30、抗重组与合成蛋白（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）、抗醌NADH脱氢酶（NAD(P)H dehydrogenase quinone 1,NQO1）、抗血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1）、抗β-肌动蛋白（beta actin,β-actin）、抗α微管蛋白（α-tubulin）、抗核纤层蛋白B抗体（Lamin B）均购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染

将大鼠椎间盘髓核细胞解冻及复苏，放置在含10%FBS+100 u/m L青霉素+1%谷氨酰+100µg/m L链霉素的DMEM/F12培养基中，在37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养，每周更换3次培养液。

将椎间盘髓核细胞分为空白对照组（Control组）、IL-1β组、IL-1β+过表达GPR30阴性对照质粒组（IL-1β+oe-NC组）、IL-1β+过表达GPR30质粒组（IL-1β+oe-GPR30组）、IL-1β+oe-GPR30+干扰Nrf2表达阴性对照质粒组（IL-1β+oe-GPR30+siNC组）、IL-1β+oe-GPR30+干扰Nrf2表达质粒组（IL-1β+oe-GPR30+si-Nrf2组），IL-1β的处理浓度为10 ng/m L。根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000进行实验。使用250µL OptiMEM培养基与2.5µg oe-NC、oe-GPR30、si-NC和siNrf2质粒单独或同时混合后静置5 min(a液），5µL Lipofectamine 2000转染试剂与250µL Opti-MEM培养基充分混合静置5 min(b液），a液与b液充分混匀后室温静置15 min，加入椎间盘髓核细胞，转染6 h弃上后清液，更换含有10 ng/m L IL-1β的培养液培养24 h。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测GPR30 m RNA表达

使用TRIzol试剂提取各细胞总RNA，并测浓度。随后，使用Prime Script™RT预混液逆转录生成c DNA。c DNA扩增是在PCR仪器上进行，以GAPDH用作归一化的内部对照。GPR30正向引物：5'-TGGGGAAGAGGCCACCA-3'，反向引物：5'-CGTGGAGCTGCTCACTCTCTG-3'，均58 bp;GAPDH正向引物：5'-AAAGGGTCATCATCTCTG-3'，反向引物：5'-GCTGTTGTCATACTTCTC-3'，均80 bp。采用2-ΔΔCt法计算GPR30 m RNA相对表达量。

1.2.3 Western blotting检测GPR30、Nrf2、HO-1及NQO1蛋白表达

从细胞中提取总蛋白，测试浓度以及纯度后。分离蛋白质并且转移至PVDF膜。用磷酸盐缓冲液密封2 h，加入抗GPR30(1∶1 000）、抗Nrf2(1∶2 000）、抗HO-1(1∶2 000）、抗NQO1(1∶2 000）、抗β-actin(1∶2 000）、抗α-tubulin(1∶2 000）、抗Lamin B(1∶2 000），在4℃过夜，将磷酸盐吐温缓冲液冲洗3次，5 min/次。接着，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000），并在37℃孵育4 h。显影，定影。使用Image图像软件分别分析各Nrf2、HO-1、NQO1、GPR30与β-actin(Lamin B或α-tubulin）积分光密度的比值作为各蛋白相对表达量。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡情况

洗涤细胞后，消化离心，收集细胞。随后用300µL结合缓冲液重悬细胞，并加入10µL膜联蛋白V-FITC溶液轻轻混合。将细胞在室温下黑暗孵育15 min，然后加入5µL PI染料和200µL结合溶液。通过流式细胞术检测细胞凋亡。

1.2.5 ELISA法检测TNF-α、IL-6水平

根据试剂盒说明书，使用ELISA试剂盒检测髓核细胞培养上清液中炎症因子IL-6和TNF-α水平。读取酶标仪上450 nm处的光密度值。

1.2.6 ELISA法检测ROS水平、分光光度法检测SOD水平、比色法检测MDA水平

收集髓核细胞培养上清液，然后使用从上海酶联生物公司获得的相应试剂盒检测ROS、SOD和MDA水平。

1.3统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组髓核细胞GRP30 m RNA、蛋白相对表达量比较

各组髓核细胞GRP30 m RNA、蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05),IL-1β组较Control组降低（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30组较IL-1β+oe-NC组升高（P<0.05）。见表1和图1。

表1各组髓核细胞GRP30 m RNA和蛋白相对表达量比较  

图1各组髓核细胞GRP30蛋白条带图  

2.2各组髓核细胞核中Nrf2蛋白相对表达量比较

Control组、IL-1β组、IL-1β+oe-NC组、IL-1β+oe-GPR30组髓核细胞核中的Nrf2蛋白相对表达量分别为（0.18±0.02）、（0.38±0.05）、（0.32±0.09）、（0.74±0.10），经方差分析，差异有统计学意义（F=32.513,P=0.000）。IL-1β组较Control组升高（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30组较IL-1β+oe-NC组升高（P<0.05）。见图2。

图2各组髓核细胞核中的Nrf2蛋白条带图  

2.3各组髓核细胞Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量比较

各组髓核细胞Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05);IL-1β组较Control组降低（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30组较IL-1β+oe-NC组升高（P<0.05）。见表3和图3。

表3各组髓核细胞的Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量比较  

图3各组髓核细胞Nrf2、HO-1及NQO1蛋白条带图  

2.4各组髓核细胞Nrf2蛋白相对表达量比较

Control组、IL-1β组、IL-1β+oe-NC组、IL-1β+oe-GPR30组、IL-1β+oe-GPR30+si-NC组、IL-1β+oe-GPR30+si-Nrf2组髓核细胞Nrf2蛋白相对表达量分别为（0.40±0.11）、（0.08±0.06）、（0.10±0.04）、(0.21±0.04）、（0.19±0.07）、（0.04±0.02）比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=12.614,P=0.000);IL-1β组较Control组降低（P<0.05),IL-1β+oeGPR30组较IL-1β+oe-NC组升高（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30+si-Nrf2组较IL-1β+oe-GPR30+si-NC组降低（P<0.05）。见图4。

2.5各组髓核细胞凋亡率比较

Control组、IL-1β组、IL-1β+oe-NC组、IL-1β+oe-GPR30组、IL-1β+oe-GPR30+si-NC组、IL-1β+oe-GPR30+si-Nrf2组髓核细胞凋亡率分别为（5.15±1.74）%、（38.27±3.18）%、（39.19±2.21）%、（25.85±3.63）%、（23.19±2.37）%、（32.16±3.16）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=61.157,P=0.000),IL-1β组较Control组升高（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30组较IL-1β+oe-NC组降低（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30+si-Nrf2组较IL-1β+oe-GPR30+si-NC组升高（P<0.05）。见图5。

图4各组髓核细胞Nrf2蛋白条带图 

图5各组髓核细胞流式细胞图  

2.6各组髓核细胞TNF-α、IL-6水平比较

各组髓核细胞TNF-α、IL-6水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05);IL-1β组较Control组升高（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30组较IL-1β+oe-NC组降低（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30+si-Nrf2组较IL-1β+oe-GPR30+si-NC组升高（P<0.05）。见表6。

2.7各组髓核细胞ROS、SOD及MDA水平比较

各组髓核细胞ROS、SOD及MDA水平比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05);IL-1β组ROS、MDA水平较Control组升高，SOD水平较Control组降低（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30组ROS、MDA水平较IL-1β+oe-NC组降低，SOD水平较IL-1β+oe-NC组升高（P<0.05),IL-1β+oe-GPR30+si-Nrf2组ROS、MDA水平较IL-1β+oe-GPR30+si-NC组升高，SOD水平较IL-1β+oe-GPR30+si-NC组降低（P<0.05）。见表7。

表6各组髓核细胞TNF-α、IL-6水平比较  

表7各组髓核细胞ROS、SOD及MDA水平比较  

3、讨论

IL-1β处理髓核细胞已被广泛用于体外模拟椎间盘退变的过程[13]。本研究首先证明IL-1β通过增加大鼠椎间盘髓核细胞凋亡、炎症及氧化应激来诱导髓核细胞损伤。笔者还发现IL-1β抑制髓核细胞中的GPR30表达。此外，笔者将过表达GPR30质粒转染入髓核细胞后，髓核细胞凋亡率下降，氧化应激损伤及炎症水平被抑制。而干扰Nrf2后逆转过表达GPR30所抑制的髓核细胞凋亡、氧化应激损伤和炎症水平。总之，本研究表明GPR30可以防止IL-1β诱导的髓核细胞凋亡、氧化应激和炎症反应，其通过调节Nrf2/ARE信号通路发挥其功能。

髓核细胞是存在于髓核中的主要细胞类型，其功能障碍会破坏细胞外基质合成和分解的平衡，而这对于维持椎间盘的生理功能十分重要[15]。越来越多的研究证实，过度的氧化应激和炎症反应在椎间盘退变的病理过程中发挥着关键作用[15]。IL-1β是椎间盘退变的主要危险因素，被认为通过触发多种促炎介质的释放而导致椎间盘退变并加速其进展[16]。更重要的是，受损的髓核细胞会进一步产生与氧化应激和炎症相关的细胞因子，这可以通过炎症级联反应进一步加剧椎间盘退变的进展[17]。此外，在退变椎间盘中广泛检测到过量的ROS，这导致脂质过氧化的最终产物MDA含量升高，并导致包括SOD在内的重要抗氧化物质水平降低[18]。

G-1是一种GPR30激动剂，被发现有改善脊髓损伤诱导的细胞凋亡和增强损伤后运动功能恢复的效果[19]。更重要的是，GPR30可减少多种疾病中ROS的积累，以及抑制氧化应激损伤和炎症反应来缓解疾病的进展[20,21]。与先前研究一致，GPR30抑制髓核细胞中ROS积累，并抑制IL-1β诱导的髓核细胞凋亡、氧化应激和炎症反应。Nrf2/ARE信号通路是一条经典的抗氧化应激通路，与椎间盘退变期间的炎症、氧化应激和细胞凋亡密切相关[22,23]。Nrf2是个关键的抗氧化调节因子。正常情况下，Nrf2处于细胞质中，活性被抑制，而氧化应激可以增强Nrf2活性。激活后的Nrf2会转移到细胞核中，并与小Maf蛋白结合形成异二聚体，该异二聚体与下游的ARE相结合，进而启动ARE调控的相关基因，如HO-1和NQO1基因的转录[23]。在本研究中，IL-1β诱导髓核细胞氧化应激后，Nrf2入核蛋白增加，且GPR30进一步促进Nrf2入核激活，Nrf2/ARE信号通路，随后促进髓核细胞中抗氧化酶HO-1和NQO1的表达，对髓核细胞发挥保护作用。

综上所述，上调GPR30表达可能通过激活Nrf2/ARE信号通路，抑制IL-1β诱导的髓核细胞凋亡、炎症和氧化应激。但本研究未探讨GPR30在椎间盘退变大鼠体内中的作用及其分子机制，具有一定局限性。因此，本研究下一步将探讨GPR30在椎间盘退变大鼠体内中的作用及其对Nrf2/ARE信号通路的调控作用。

参考文献:

[14]张文捷,张勇,史明,等淫羊莹苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变[J]中国组织工程研究,2023,27(24):3803-3809.

文章来源:肖权洲,卿亚龙,陈特等.GPR30对大鼠椎间盘退行性病变的作用及其机制研究[J].中国现代医学杂志,2024,34(02):53-59.