骨质疏松症是骨科常见的全身代谢性骨骼疾病，研究表明，骨质疏松患者平时受到轻微的创伤就可能发生骨折，故骨质疏松性骨折(osteoporosis fracture, OPF)是其最严重的并发症之一[1,2]。众所周知，骨折的愈合是一个复杂且相对漫长的生物学过程，OPF患者相比于正常骨折患者，更易出现骨折延迟愈合、甚至不愈合的情况，这对患者及其家属、甚至是社会都造成了一定负担，因此，如何促进骨折愈合一直是临床亟需解决的问题[3,4,5]。

近年来研究发现，松质骨中血流下降与骨折发生率升高有关，且骨折后极易伴随血管及神经损伤，而这也是影响骨折愈合的关键因素，因此无论是对骨质疏松患者还是对OPF患者，促进血管生成都尤为重要，其可提供更好的血供，从而改善骨组织代谢，促进新骨形成[6]。活化T细胞核转录因子c1(nuclear factorof activated T-cells cytoplasmic 1,NFATcl)是一种重要的转录因子，研究发现，其所在信号通路可参与破骨细胞形成及分化的调控，而OPF的发生与破骨细胞的过度激活密切相关，由此可见NFATcl信号通路可能在OPF发生、发展中发挥至关重要的作用[7]。

富血小板血浆是一种血小板浓缩制剂，所含血小板浓度是全血的4～6倍，此外还含有大量的生长因子及高浓度活性纤维蛋白，具有显著的组织修复能力，且大量研究证实其在促进骨折愈合方面具有显著作用[8]。玻璃酸钠作为关节液、关节软骨主要成分，在维持关节生物力学、保护软骨功能等方面具有重要作用，已被广泛应用骨关节炎等骨科疾病的治疗，且近年来对于骨折愈合也已取得了喜人的效果[9]。但富血小板血浆及玻璃酸钠对OPF方面的研究相对较少，因此本研究以富血小板血浆联合玻璃酸钠对骨质疏松性骨折大鼠骨愈合、血管生成及NFATc1信号通路的影响进行探讨，以期为临床治疗提供新的治疗靶点。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1动物材料：

60只SPF级SD雌性大鼠选自广州弗尔博生物科技有限公司[合格证书：SCXK(粤)2021-0012],平均体重210～270 g,单笼喂养，环境温度为(21±4)℃,湿度为46%～62%,模仿12 h昼夜交替，无菌自由进食、饮水2周，按照《实验动物管理条例》规定进行实验。本实验经过河北省沧州中西医结合医院伦理委员会批准(批准文号：2022-0309)。

1.1.2实验材料：

富血小板血浆(货号：PR0229,北京普非有限公司);玻璃酸钠(货号：AVT00001,上海艾伟拓有限公司);小动物骨密度仪(型号：RZ,上海然哲有限公司);生物力学试验机(型号：HY-0350,上海衡翼有限公司);苏木素染液(货号：ZY1850,上海泽叶有限公司);伊红染液(货号：BL703B,杭州铭特有限公司);光学显微镜(型号：E100,上海普赫有限公司);酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(货号：JEH-01,上海中乔新舟有限公司);RIPA裂解液(货号：E-BC-R327,武汉伊莱瑞特有限公司);SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒(货号：BM0687,上海圻明有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：PR1711,北京普非有限公司);NFATc1抗体(货号：XGK0377,上海西格有限公司);OSCAR抗体(货号：GOY-01K1393,上海谷研有限公司司);GAPDH抗体(货号：WB2197,上海威奥有限公司);ECL检测试剂盒(货号：KL-D3095,上海康朗有限公司)。

1.2方法

1.2.1建模：

随机选取50只大鼠，通过腹腔注射3%戊巴比妥纳麻醉大鼠，行双侧卵巢切除术，术毕逐层缝合伤口，并肌肉注射5万U青霉素钠以预防感染。将大鼠放回笼内，常规饲养12周，用小动物骨密度仪检测大鼠骨密度，若骨密度显著低于造模前则视为骨质疏松模型构建成功。然后经腹腔注射3%戊巴比妥纳麻醉大鼠，暴露左侧股骨，将股骨中段横行锯断，用克氏针固定后，生理盐水冲洗，术毕逐层缝合伤口，造模过程中死亡3只，其余均建模成功。

1.2.2分组及给药：

随机选取成功建模大鼠40只，并随机分为模型(MO)组，富血小板血浆(PP)组，玻璃酸钠(SH)组，富血小板血浆联合玻璃酸钠(PS)组，每组10只，取剩余10只健康大鼠作为正常(NO)组，对PP组骨折断端注射0.2 mL/只富血小板血浆，对SH组骨折断端注射10 mg/kg玻璃酸钠，对PS组骨折断端注射0.2 mL/只富血小板血浆及10 mg/kg玻璃酸钠，两组均每天给药1次，治疗2个月，NO组、MO组同期对骨折断端注射同体积生理盐水。

1.2.3标本采集：

实验完成后，经腹腔注射3%戊巴比妥纳麻醉处死大鼠，取静脉血，离心取上清液于无菌离心管中，在冰箱中密封保存。然后取1 cm骨折端骨痂组织用小动物骨密度仪检测骨密度，检测完成后，取左侧股骨，用生物力学试验机检测骨生物力学。检测完成后，在含4%多聚甲醛溶液中固定48 h, 10%乙二胺四乙酸脱钙14 d,进行常规石蜡包埋、切片后，放入冰箱中密封保存。

1.2.4 HE染色：

取各组股骨组织，脱蜡、复水后，流水冲洗1 min,苏木素染色30 s,流水冲洗5 min,分色、返蓝处理后，流水冲洗5 min,伊红染色3 min, PBS洗涤3次，脱水、透明、中性树胶封片后，在光学显微镜下观察，选8个视野观察新生血管情况，收集血管面积及新生血管数。

1.2.5 ELISA检测：

取各组大鼠血清，检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1,ANG-1)等血管形成相关因子，实验步骤严格按试剂盒说明书进行操作，实验完成后，通过标准曲线，计算VEGF、bFGF、ANG-1的含量。

1.2.6免疫印迹检测：

取各组股骨组织，加入少许液氮研磨成匀浆后，加入RIPA裂解液，4℃摇床过夜裂解，离心取上清液，用BCA法提取细胞核蛋白，变性后进行电泳、转膜处理，洗涤液洗涤后封闭2 h,加入稀释的NFATc1、破骨细胞关联受体(osteoclast associated receptor, OSCAR)一抗(1∶1 000),4℃孵育过夜，洗膜，加入稀释的二抗(1∶5 000),37℃孵育2 h,洗膜，ECL试剂盒测定结果后，计算与GAPDH比值求得NFATc1、OSCAR蛋白表达。

1.3统计学

采用GraphPad Prism8.0对各组大鼠骨愈合、血管生成、NFATc1信号通路相关指标进行统计分析，组间进行t检验、多组间比较采用单因素方差分析，描述采用均数±标准差，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠骨密度及骨生物力学结果

与NO组相比，MO组骨密度、刚度、最大载荷、最大压强、弹性模量显著降低(P<0.05),与MO组相比，PP、SH、PS组骨密度、刚度、最大载荷、最大压强、弹性模量明显升高(P<0.05),且SH、PP组比较无明显差异(P>0.05),PS组比SH组升高明显(P<0.05),这说明富血小板血浆联合玻璃酸钠可显著改善骨质疏松性骨折大鼠骨密度及骨生物力学，见表1。

表1各组大鼠骨密度及骨生物力学比较

2.2各组HE染色结果

NO组股骨组织结构正常，骨小梁生长旺盛，可见大量成熟骨组织，MO组股骨组织遭到破坏，骨小梁明显减少，骨密质明显变薄，与MO组比较，PP、SH、PS组病理结构明显改善，骨小梁变粗变密，空骨陷窝明显减少，这说明富血小板血浆联合玻璃酸钠可显著改善骨质疏松性骨折大鼠骨组织病理形态，见图1。

图1各组大鼠骨组织HE染色(×200倍)   

2.3各组大鼠股骨组织血管生成结果

与NO组相比，MO组血管数量及血管面积明显降低(P<0.05),与MO组相比，PP、SH、PS组血管数量及血管面积明显升高(P<0.05),且SH、PP组比较无明显差异(P>0.05),PS组比SH组升高明显(P<0.05),这说明富血小板血浆联合玻璃酸钠可显著促进骨质疏松性骨折大鼠血管生成，见表2。

2.4各组大鼠血清血管形成相关因子水平结果

与NO组比较，MO组血清VEGF、bFGF、ANG-1水平明显降低(P<0.05),与MO组相比，PP、SH、PS组血清VEGF、bFGF、ANG-1水平明显升高(P<0.05),且SH、PP组比较无明显差异(P>0.05),PS组比SH组升高明显(P<0.05),这说明富血小板血浆联合玻璃酸钠可显著促进骨质疏松性骨折大鼠血管生成，见表3。

2.5各组大鼠骨组织NFATc1信号通路蛋白表达结果

与NO组比较，MO组骨组织NFATc1、OSCAR蛋白表达明显升高(P<0.05),与MO组比较，PP、SH、PS组股骨组织NFATc1、OSCAR蛋白表达明显降低(P<0.05),且SH、PP组比较无明显差异(P>0.05),PS组比SH组降低明显(P<0.05),这说明富血小板血浆联合玻璃酸钠可显著抑制骨质疏松性骨折大鼠NFATc1信号通路，见表4、图2。

表2各组大鼠股骨组织血管数量及血管面积比较

表3各组大鼠血清中血管形成因子水平比较

表4各组大鼠股骨组织NFATc1、OSCAR蛋白表达比较

图2各组大鼠骨组织NFATc1、OSCAR蛋白表达电泳图  

3、讨论

众所周知，骨质疏松患者骨强度较低，发生骨折后多为粉碎性，这使得OPF患者不仅骨愈合能力差，也极易发生内固定松动及再骨折情况，故OPF也是患者致残、致死的主要原因。因此，如何促进骨折愈合、防止再骨折情况的发生是目前医学领域亟待解决的问题[10]。近年来，富血小板血浆因其制备简单、价格低廉、安全性高的优点被广泛应用于临床，在骨折治疗方面也取得了令人满意的效果。研究发现，其可提供一种富含生长因子的微环境，从而更有利于促进成骨、破骨细胞的增殖及迁移，进而加快骨折的修复与重建，促进骨愈合[11]。玻璃酸钠是一种高分子多糖体生物材料，具有抗感染、润滑关节、防止软骨基质破坏、维持骨生物力学及镇痛等多种生理功能，由此可见其在治疗OPF方面应该具有一定前景[12]。通过将富血小板血浆与玻璃酸钠联合使用，可以起到互补作用，从而更利于达到促进骨折愈合和骨重建的目的。因此，本研究选择富血小板血浆与玻璃酸钠联用进行实验，以期为临床提供更多治疗方案。本研究发现，富血小板血浆联合玻璃酸钠对OPF大鼠具有显著疗效，可显著促进骨折愈合。对于OPF大鼠，富血小板血浆联合玻璃酸钠可能是通过多途径、多功能，来促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞功能，从而刺激细胞有丝分裂，促进骨基质细胞分化，诱导软骨基质合成，进而促进骨形成，抑制骨吸收，达到促进骨痂生成的目的，最终有效促进骨折愈合。黄星等[13]研究表明，对于OPF大鼠，富血小板血浆具有显著效果，可显著促进骨折愈合，这与本研究结果类似。

骨折的修复和再生是一个复杂的生物学过程，而大量研究已经证实，骨愈合需要血管生成过程，故促进血管生成是促使骨折愈合的首要条件，其不仅可以参与膜内成骨和膜外化骨，还可以保证良好的血供，为骨折愈合提供有利条件，因此如何促进血管生成已经成为近年来骨科领域关注的焦点之一[14]。VEGF、bFGF、ANG-1是促进新生血管生成的重要因子，在血管生成中扮演着重要角色，其可调控多种信号通路，从而加速血管内皮等细胞增殖，促进新生血管生成，因此检测其水平的变化可有效反映血管生成情况[15]。本研究结果表明，富血小板血浆联合玻璃酸钠可显著提高骨组织血管数量及血管面积，并升高血清VEGF、bFGF、ANG-1含量，这说明其可显著促进OPF大鼠血管生成。对于OPF大鼠，富血小板血浆联合玻璃酸钠可能是通过提供骨折愈合所需要的生长因子及营养，从而为组织修复提供了一个载体及框架，进而加快VEGF、bFGF、ANG-1等促血管生成因子的分泌，加快骨质矿化，加快细胞外基质及纤维合成等，最终达到促进血管生成，加快骨折愈合的目的。袁园等[16]研究发现，富血小板血浆可促进缺血下肢血管生成，从而促进其血流恢复，与本研究结果相似。

近年来研究发现，破骨细胞过度激活是骨质疏松患者易发生骨折的根本原因，其可造成骨吸收和重建的不平衡，从而导致骨微结构遭到破坏，进而导致骨量减少，骨强度下降，最终导致骨折，因此如何抑制破骨细胞过度激活是目前临床研究的关键所在[17,18]。NFATc1信号通路作为调控破骨细胞功能的网络中心，其在破骨细胞形成及分化过程中发挥着极为重要的作用，因此临床对其越来越关注及重视[19]。本研究结果发现，富血小板血浆联合玻璃酸钠可显著抑制股骨组织NFATc1、OSCAR蛋白表达，这说明其可显著抑制OPF大鼠NFATc1信号通路。而对于OPF大鼠，富血小板血浆联合玻璃酸钠可能是通过调节相关基因表达，来介导细胞信号转换，从而抑制NFATc1信号通路的激活，抑制破骨细胞活性及骨基质降解，进而抑制骨吸收，促进骨形成，最终有效促进骨愈合。王琮仁等[20]研究发现，对于OPF大鼠，阿托伐他汀可显著促进骨愈合，其作用机制可能与抑制NFATc1信号通路有关，这与本研究结果相似。

综上所述，富血小板血浆联合玻璃酸钠对骨质疏松性骨折大鼠具有显著疗效，可有效促进骨愈合及血管生成，并抑制NFATc1信号通路。但本研究仍存在一定的问题，由于时间原因，未深入到细胞层面，也未进行更多信号通路及指标的研究。后续会逐步展开进一步的深入研究，以期为临床提供更多、更有利的诊疗依据。

参考文献:

[8]刘汉胤.自体富血小板血浆联合锁定钢板内固定术治疗骨质疏松性桡骨远端骨折的疗效研究[D].宜昌:三峡大学,2022.

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[11]陈功财,靳桂阳,双峰,等.富血小板血浆联合同种异体骨植骨在老年Pilon骨折内固定术中的应用[J].中国骨与关节损伤杂志,2022,37(4):418-421.

[12]洪如伟,梁鹿章,洪艺秦,等.关节腔内注射玻璃酸钠对胫骨平台骨折术后膝关节炎症及功能影响[J].实用骨科杂志,2020,26(3):273-276.

[13]黄星,欧锐金,李国兴.富血小板血浆联合强骨胶囊对大鼠骨质疏松性骨折骨愈合的影响[J].广州医药,2020,51(4):1-4.

[15]史桂荣,任博文,张仲博,等.红茴香提取物干预骨质疏松性大鼠骨折后的血管生成[J].中国组织工程研究,2023,27(31):5028-5034.

[16]袁园,张潇,邵菊,等.富血小板血浆对小鼠下肢缺血血管生成的作用研究[J].重庆医学,2019,48(2):198-201.

[17]邓满香,陈鹭玲,何剑全.鸡冠花黄酮对骨质疏松大鼠TMAO/NF-κB/NFATc1水平的影响[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(10):1485-1490.

[18]陈振东,于建农,陈杰.唑来膦酸促进大鼠骨质疏松性骨折愈合的实验研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(4):538-542.

[20]王琮仁,孔长庚,郭祥,等.阿托伐他汀通过NFATc1信号通路促进大鼠骨质疏松性骨折愈合[J].临床外科杂志,2022,30(6):583-585.

基金资助:河北省卫生健康委医学科学研究基金项目(20200611);

文章来源:马超,潘浩,崔润之等.富血小板血浆联合玻璃酸钠对骨质疏松性骨折大鼠的影响[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(01):44-49.