长期经常性高脂饮食，能量摄入超过消耗，会导致脂质代谢紊乱，引发代谢综合征[1]。非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）以甘油三酯在肝脏蓄积和肝脂肪变性为特征，是代谢综合征在肝脏的局部表现[2,3]。NAFLD的患病人数约占全球总人口的四分之一，我国NAFLD患病率高达29.2%，为第一大肝病，还可发展为肝硬化甚至肝癌，对人类生命健康造成了极大的困扰[4,5]。NAFLD一般从病史、临床表现、影像学、血清学和组织病理学进行诊断[6]，但发病机制复杂且尚不清楚，其治疗大多以进行生活方式干预为主，目前还未有特效药物[7]。

动物模型是疾病发病机制研究、治疗药物研发及防治策略寻找的重要工具[8]。建立稳定、理想的NAFLD模型是研究疾病的重要基础，也是降脂新药研发所需要的。目前NAFLD动物模型的建立方法主要分为化学物质诱导模型、基因编辑诱导模型、饮食诱导模型等[9]。NAFLD发病率因饮食习惯改变而增加，肥胖人群增长与NAFLD患病率呈正相关[10]。高脂饮食（high fat diet,HFD）诱导的NAFLD模型操作简便、死亡率低、成本较低，与人类患病的病理生理方面较为相似[11]，故成为NAFLD动物模型最基础且最广泛的方法[12,13,14,15,16]，大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、猴、兔等实验动物均适用[17]。但目前的文献报道中，关于这一模型评价的研究仍然比较缺乏，且大鼠的高脂饲料配方种类众多，建模效果也不稳定[18,19,20,21]。

基于此，本研究通过探索在饲料中添加不同比例的胆固醇、猪油、胆盐等常用造模剂，考察不同配方高脂饲料诱导大鼠NAFLD模型的效果，希望找到一个能诱导稳定NAFLD模型的大鼠高脂饲料配方，为改善NAFLD的造模方法提供更多的实验依据。

1、材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，SPF等级，雄性，5～6周，体质量180 g左右，购于河北伊维沃生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（冀）2022-002。饲养温度为20～26℃，昼夜光照节律，设定自由摄食、饮水。

普通饲料：购于小黍有泰（北京）生物科技有限公司，组成：酪蛋白、蛋氨酸、玉米淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖、纤维素、大豆油、碳酸钙、磷酸二氢钾、重酒石酸胆碱等。高脂饲料：于小黍有泰（北京）生物科技有限公司定制，成分含量以质量分数表示。高脂饲料1(HFD1):10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆酸钠、78.8%普通饲料。高脂饲料2(HFD2):15%猪油、蔗糖20%、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠、63.6%普通饲料。高脂饲料3(HFD3):20%猪油、蔗糖10%、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、67.5%普通饲料。

1.2 试剂和仪器

丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（美国西门子医学诊断股份有限公司，批号分别为628337、628380）；甘油三酯（TG）试剂盒，总胆固醇（TC）试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒（美康生物科技股份有限公司，批号分别为230321201、230904101、230530101、230705201）；白介素-1β(IL-1β）试剂盒，白介素-6(IL-6）试剂盒，肿瘤坏死因子α(TNF-α）试剂盒（四川沃文特生物技术有限公司，批号分别为304021、309031、301012）。

ADVIA Chemistry XPT型全自动生化分析仪（美国西门子医学诊断股份有限公司）；LA2000全自动化学发光免疫分析仪（四川沃文特生物技术有限公司）；Centrifuge5417R型低温离心机（德国Eppendorf公司）；精密电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；全数字化高端彩色多普勒超声诊断仪（飞利浦公司）；全功能64排128层CT（美国GE公司）；1.5T高场强磁共振（德国西门子公司）。

1.3 实验动物分组及造模

适应性喂养SD大鼠2周后，将40只大鼠随机分为4组（n=10），分别为对照组、HFD1组、HFD2组、HFD3组。对照组给予普通饲料，HFD1组、HFD2组、HFD3组分别给予相应配方的高脂饲料，连续饲喂8周。实验期间每天记录大鼠摄食量、体质量，并观察各组大鼠基本情况。

1.4 标本采集及处理

造模8周结束后，大鼠禁食不禁饮12 h，腹主动脉采血，分离血清，冷冻保存；动物处死后，迅速取出新鲜肝脏，用冷生理盐水漂洗、吸水纸吸干水分后，观察各组大鼠肝脏外观并称量肝湿重。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况观察及记录

实验期间，每日观察各组大鼠体质量、摄食量、精神状态、活动情况、毛发情况、粪便、对外界刺激的反应及有无死亡等。

1.5.2 肝功能、血脂水平及炎症因子的测定

取大鼠血清，检测血清AST、ALT、TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量及炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.5.3肝指数、Lee’s指数的测定

称取每组大鼠的体质量、体长（从大鼠鼻端至肛门间的长度）、肝质量。分别按式（1）、式（2）计算其肝指数、Lee’s指数。

1.5.4 影像学检查

第8周末，每组大鼠禁饮食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.3 m L/100 g）麻醉，仰卧位四肢固定后，行超声、计算机断层扫描（CT）、核磁共振成像（MRI）等影像学检查。

1.5.4. 1 超声检查

各组大鼠腹部备皮，涂上耦合剂，超声波探头探查肝脏的不同部位。主要检查大鼠的肝脏实质回声情况、肝脏包膜情况、肝脏门静脉及其他血管情况，观察肝脏声像图，根据检查结果进行诊断[22]。

1.5.4. 2 CT检查

肝脏CT扫描范围从膈顶至肝右叶下缘，扫描参数：80 k V，自动m A，层厚0.625mm，束宽40 mm，螺距0.985:1，旋转时间0.4 s。

CT值大小代表组织密度的高低，正常人体肝脏CT值约为60 HU，脂肪CT阈值为-250～30 HU。肝脏CT值与脂肪沉积量为明显负相关。正常个体的肝CT值可能差异较大，但总体较高于脾脏，而脾脏CT值相对恒定，因此临床上常用肝/脾CT值比值来判断是否患有脂肪肝。诊断依据为：0.7<肝/脾CT值比值<1.0时，为轻度NAFLD;0.5<肝/脾CT值比值≤0.7时，为中度NAFLD；肝/脾CT值比值≤0.5时，为重度NAFLD。

1.5.4. 3 MRI检查

MRI扫描采用动物专用线圈，扫描范围为膈顶至肝下缘，扫描序列名称：t1-fl2d-opp-in-tra-p2-mbh。具体参数，FOV:164;Slice thickness:6 mm;TR:120 ms;TE:3.09 ms。

MRI检查无电离辐射，无创伤性，具有极高的软组织分辨力，且可多方位成像，对脂肪肝诊断具有重要意义。利用磁共振特有的同反相位扫描序列进行脂肪肝的研究。同相位图像（inphase），肝细胞内的水和脂肪信号相加；反相位图像（out-of-phase），肝细胞内水和脂肪信号相减。当肝细胞内有一定量的脂肪组织时，同相位和反相位信号强度出现比较明显的差异；脂肪含量越多这种信号差异就越明显。通过观察磁共振图像中同一层面、同一位置肝脏的信号高低差异来认定有没有脂肪肝，以及脂肪肝的轻重程度。

1.5.5 大鼠肝脏大体形态观察

解剖后取各组大鼠肝脏，肉眼观察其大小、颜色、形状等形态特征。

1.6 统计学处理

采用SPSS 24.0软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 不同高脂饲料配方对大鼠一般情况的影响

实验期间，对照组大鼠精神状态良好，毛发光亮，反应敏捷，灵活好动。与对照组比较，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠腹部肿胀、精神萎靡、毛发日渐疏松且无光泽、反应迟钝；对照组大鼠大便呈正常黑褐色，而HFD1组、HFD2组大鼠大便呈黄褐色，HFD3组大鼠大便呈淡绿色且有脂肪堆积。

2.2 不同高脂饲料配方对大鼠体质量的影响

造模前各组大鼠体质量无明显差异。与对照组大鼠相比，造模1周后开始，持续至8周，HFD2组、HFD3组大鼠体质量明显增加（P<0.01）；造模3周后开始，持续至8周，HFD1组大鼠体质量明显增加（P<0.05或P<0.01）。与HFD1组、HFD2组大鼠相比，HFD3组大鼠体质量增加更明显，如Tab.1所示。

2.3 不同高脂饲料配方对大鼠摄食量的影响

造模前各组大鼠摄食量无明显差异。饲养8周期间，由Fig.1可知，各组大鼠摄食量变化趋势相似，但对照组大鼠摄食量基本高于各高脂饲料组，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠摄食量依次减少，可能与高脂饲料中掺入了猪油、胆固醇等油腻性成分，热量较高，饲料变软、有异味等原因有关。

2.4 不同高脂饲料配方对大鼠肝功能水平的影响

ALT和AST水平可反映肝细胞受损程度，是目前临床上最常用的肝功能检测指标。当肝损伤发生时，ALT、AST水平会显著升高。由Fig.2可知，与对照组相比，HFD1组大鼠血清ALT、AST水平均显著升高（P<0.05),HFD2组、HFD3组显著或极显著升高（P<0.05,P<0.01）。此外，HFD1组、HFD2组大鼠血清ALT水平显著低于HFD3组（P<0.05),AST水平显著或极显著低于HFD3组（P<0.05,P<0.01）。说明HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型肝损伤程度更重。

2.5 不同高脂饲料配方对大鼠血脂水平的影响

脂质代谢紊乱是引起NAFLD的重要因素，长期高脂饮食会引起大鼠体内脂质代谢紊乱，导致大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低。由Fig.3可知，与对照组相比，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠血清TG含量均极显著升高（P<0.01);HFD1组大鼠血清TC含量显著升高（P<0.05),HFD2组、HFD3组大鼠血清TC含量极显著升高（P<0.01);HFD2组大鼠血清HDL-C含量显著降低（P<0.05),HFD3组大鼠血清HDL-C含量极显著降低（P<0.01);HFD1组、HFD2组大鼠血清LDL-C含量显著升高（P<0.05),HFD3组大鼠血清LDL-C含量极显著升高（P<0.01）。此外，HFD1组大鼠血清TG水平显著低于HFD3组（P<0.05);HFD1组、HFD2组大鼠血清TC水平显著或极显著低于HFD3组（P<0.05,P<0.01);HFD1组、HFD2组大鼠血清HDL-C水平显著或极显著高于HFD3组（P<0.05,P<0.01);HFD1组、HFD2组大鼠血清LDL-C水平显著低于HFD3组（P<0.05）。说明HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型脂质代谢异常更为明显。

2.6 不同高脂饲料配方对大鼠血清炎性细胞因子的影响

非酒精性脂肪肝状态下，肝脏受损，激活炎性反应，进而导致炎症因子的产生。由Fig.4可知，与对照组相比，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠血清TNF-α含量均极显著升高（P<0.01);HFD1组大鼠血清IL-1β、IL-6含量显著升高（P<0.05),HFD2组、HFD3组大鼠血清IL-1β、IL-6含量极显著升高（P<0.01）。此外，HFD1组、HFD2组大鼠血清TNF-α水平显著或极显著低于HFD3组（P<0.05,P<0.01);HFD1组、HFD2组大鼠血清IL-1β水平显著或极显著低于HFD3组（P<0.05,P<0.01);HFD1组、HFD2组大鼠血清IL-6水平显著低于HFD3组（P<0.05）。说明HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型肝脏炎症更为严重。

2.7 不同高脂饲料配方对大鼠Lee’s指数、肝指数的影响

与对照组相比，HFD2组大鼠的Lee’s指数显著升高（P<0.05),HFD3组大鼠的Lee’s指数极显著升高（P<0.01);HFD1组、HFD2组大鼠的肝指数均显著升高（P<0.05),HFD3组大鼠的肝指数极显著升高（P<0.01）。此外，HFD1组、HFD2组大鼠肝指数显著低于HFD3组（P<0.05）。如Tab.2所示，说明HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型肥胖状态，肝组织的异常改变更为明显。

2.8 不同高脂饲料配方大鼠影像学检查

2.8.1 不同高脂饲料配方大鼠超声检查

超声影像学显示，对照组大鼠肝脏体积正常，被膜光滑，实质回声均匀，肝内管状结构显示尚清。HFD1组大鼠肝脏体积稍增大，被膜尚光滑，实质回声细腻，肝内管状结构显示尚清。HFD2组大鼠肝脏体积稍增大，被膜尚光滑，实质回声增强，肝内管状结构显示欠清。HFD3组大鼠肝脏体积增大，被膜尚光滑，实质回声增强，后方回声衰减，肝内管状结构显示不清。见Fig.5。不同配方高脂饲料大鼠超声诊断情况如Tab.3所示，与对照组相比，HFD3组差异具有统计学意义（P<0.01）。与HFD3组相比，HFD1组、HFD2组差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。提示HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型肝脏病变程度更为严重。

2.8.2 不同高脂饲料配方大鼠CT检查

对大鼠CT图像进行分析，见Fig.6A，得到其CT值及肝/脾CT值比值。与对照组比较，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠肝脏CT值显著降低或极显著降低（P<0.05,P<0.01），且HFD1组、HFD2组大鼠肝脏CT值显著或极显著高于HFD3组（P<0.05,P<0.01），见Fig.6B。与对照组比较，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠肝/脾CT值比值均极显著降低（P<0.01），且HFD1组、HFD2组大鼠肝/脾CT值比值显著或极显著高于HFD3组（P<0.05，或P<0.01），见Fig.6C。提示HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型脂肪肝更为严重。

2.8.3 不同高脂饲料配方大鼠MRI检查

不同配方高脂饲料大鼠MRI检查采用磁共振“双回波同反相位（in-out phase）”序列扫描，通过观察肝实质同反相位图像是否有不一致的信号强度，来对各组大鼠做出NAFLD程度的判断。NAFLD时，反相位图像与同相位图像相比，肝脏信号减低，脂肪肝越严重，信号减低越明显。由Fig.7可知，与对照组比较，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠同/反相位图上肝脏实质信号差别明显，其中HFD3组大鼠信号减低最为明显。提示HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型脂肪肝程度更重。

2.9 不同高脂饲料配方大鼠肝脏外观

如Fig.8所示，对照组大鼠肝脏体积较小、外观红润、表面光滑、色泽鲜亮、边缘锐利、无脂肪变性。HFD1组大鼠肝脏表面光滑，较空白组光泽度差、有轻微脂肪变性。HFD2组大鼠肝脏体积肥大、颜色较浅、光泽度差，表面粗糙凹凸不平，脂肪变性较HFD1组明显。HFD3组大鼠肝脏体积肥大、颜色不均、光泽度差，表面粗糙凹凸不平、边缘钝化、易碎、出现土黄色局灶性脂肪沉积，包膜紧张且与周围组织有粘连。提示HFD3高脂饲料诱导的NAFLD大鼠模型脂肪变性程度更高。

3、讨论

我国NAFLD的发病率逐年上升，且趋向于年轻化，对其进行研究具有重大意义，而其动物模型的制作对研究NAFLD极为重要。NAFLD患病率的增加主要与食物数量及成分改变有关，多为高热量、高脂肪特征的西方膳食模式[23]。喂饲HFD诱发大鼠NAFLD是常用的动物模型建立方法，其病因、发病背景方面与此类似，且要求低、简便，实验条件易于控制、重复性好、采血量大[24,25]。

HFD的配方是影响大鼠NAFLD模型成功建立的关键。近年众多研究表明，大鼠的HFD配方种类多样，但未见对其造模效果对比的研究报道。NAFLD建模所用HFD一般的配比为普通饲料60%～88%，猪油10%～20%，胆固醇1%～2%，胆盐0.2%～0.7%，及蛋黄粉、豆油等其他成分。HFD中胆固醇的添加使大鼠外源性胆固醇摄入增加，导致其累积在细胞内或血管内，从而脂肪肝形成。猪油主要由饱和脂肪酸甘油酯与不饱和脂肪酸甘油脂组成[26]。两者的含量对模型建立效果影响较大。因此本实验考察了HFD1（普通饲料78.8%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%、胆盐0.2%）、HFD2（普通饲料63.6%、猪油15%、蔗糖20%、胆固醇1.2%、胆盐0.2%）、HFD3（普通饲料67.5%、猪油20%、蔗糖10%、胆固醇2%、胆盐0.5%)3种不同配方HFD建立NAFLD大鼠模型的效果，对造成大鼠NAFLD模型的HFD配方进行了筛选，其主要区别在于饲料中猪油和胆固醇的含量。综合起来，HFD3组（基础饲料67.5%、猪油20%、蔗糖10%、胆固醇2%、胆盐0.5%）在各方面均有优势，提示对于建立稳定的大鼠NAFLD模型，HFD3组饲料为佳。

NAFLD发生通常会出现不同程度的脂代谢紊乱和肝损伤[27]，本研究结果显示，HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠精神变差、活动减少、脱毛现象加重、摄食量减少、体质量明显升高、肝指数、Lee’s指数显著提高，肝脏体积增大，边缘较钝，可见脂肪变性和沉积，且以HFD3组大鼠变化最明显。肝脏损伤，血清中的转氨酶水平显著上升，ALT和AST是反映肝细胞受损程度最灵敏的指标[28]，而TC、TG、HDL-C和LDL-C体现机体脂质水平[29]。此外，典型的炎症反应也是NAFLD的主要病理表现。实验结果显示HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平均显著升高，而HDL-C水平明显下降；促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著增加，且HFD3组更为明显，表明HFD已造成大鼠血脂异常、肝脂质堆积以及肝损伤，HFD3对于大鼠血清相关生化指标、炎症因子水平影响更大，更利于构建NAFLD模型[30]。

目前国内研究大多以体质量、肝指数、Lee’s指数、生化指标、肝脏病理等作为判定NAFLD建模是否成功的标准，存在创伤大、标本量取样不足等弊端，其中肝脏病理学检查是NAFLD评估的金标准，但由于其具有侵入性、采样变异性，且可重复性差等不足，选择活体筛查的方法很有必要。而B超、MRI和CT等无创影像学检查是临床脂肪肝的常规评估手段，操作简便、重复性好、敏感性相对较高，可依据其信号特征间接的判断肝脏病理学变化，且不经剖腹或处死动物便可进行随访[31,32]。本研究选择了B超、CT及MRI筛查的方法，判断大鼠NAFLD模型建立成功与否，结果显示HFD1组、HFD2组、HFD3组大鼠肝脏体积增大，肝实质回声增强，后方回声衰减，肝内管状结构显示不清；肝和脾的CT值比值明显降低；与同相位MRI相比，反相位图上肝脏信号明显减低，且HFD3对于大鼠影像学变化影响更大，更利于构建NAFLD模型。表明HFD可造成明显大鼠影像学肝组织脂肪性病变，B超、CT及MRI筛查结果与血清学等其他检测结果趋势一致，可能成为活体筛选NAFLD大鼠的理想指标，也为其他模型制备评价提供了新思路。

综上所述，三种高脂饲料喂养SD大鼠8周后，均可建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，但HFD3组诱导非酒精性脂肪肝大鼠模型优于其他两组，病变相对严重，预计维持时间也更长，更适于非酒精性脂肪肝病的机制研究和降脂药物的筛选。

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基金资助:河北省自然科学基金-生物医药联合基金培育项目资助项目(H2021208003);

文章来源:赵梓硕,朱玉光,马燕山,等.不同高脂饲料配方对建立非酒精性脂肪肝大鼠模型的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(05):543-553.