小泛素相关修饰物（small ubiquitin⁃related modifier,SUMO）修饰是蛋白质翻译后修饰的一种，其能够调控蛋白的相互作用、活性及亚细胞定位[1]，从而调节多种细胞进程。与泛素化过程类似，SUMO化修饰是一个动态可逆的过程，SUMO前体在泛素样蛋白加工酶（ubiquitin⁃like protein⁃specific protease,ULP）或SUMO特异性蛋白酶（sentrin⁃specific protease,SENP）的加工下产生SUMO⁃GG，由SUMO E1酶（Aos1⁃Uba2）激活，转移到SUMO E2酶（Ubc9），并通过SUMO E3连接酶（PIAS）与底物结合，最后，修饰底物可通过ULP/SENP发生去SUMO化，使蛋白质的SUMO化和去SUMO化处于动态平衡状态[2,3]。

在哺乳动物中，去SUMO化酶SENP共有6种，SENP1作为去SUMO化酶之一，拥有广泛的特异性底物，这些底物参与多种细胞生物学过程，如信号转导、细胞增殖、凋亡等[4,5,6]。近年来，越来越多的研究发现SENP1在多种肿瘤中呈现出异常的高表达[7,8,9,10]，促进肿瘤的发生发展，如在乳腺癌中，高表达的SENP1通过调控细胞周期素依赖性激酶p21、p27以及基质金属蛋白酶9的表达促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。由于SENP在肿瘤中的重要作用，其已被确定为肿瘤治疗的分子靶标[11]。

SPOP(speckle type BTB/POZ protein）是泛素连接酶E3家族成员Cul3结合底物的接头蛋白，介导许多核蛋白的泛素化修饰，导致蛋白降解，从而调控细胞的多种生理过程[12]。已有研究证实，SPOP的缺失或突变与多种肿瘤密切相关，包括前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌等[13,14]。其中受SPOP影响最为显著的是肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）。SPOP蛋白在正常肾脏组织中表达量非常低，但在99%的ccRCC组织中却大量表达，表明SPOP蛋白是一个潜在的ccRCC分子标志物。由于SPOP在ccRCC中的重要作用，其已被确定为ccRCC治疗的新靶点。前人根据SPOP所识别底物蛋白的晶体结构特点，获得了能够与SPOP蛋白结合的小分子化合物，并在体内和体外验证了其作用[15,16]。ccRCC中SPOP的相关研究虽然很多，但其在ccRCC中特异性高表达的机制还未见报道。

2022年Lee等[17]发现，去SUMO化酶SENP1在ccRCC中存在异常的高表达。本课题组通过实验发现，在Senp1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（murine embryonic fibroblasts,MEFs）中，Spop的蛋白水平有所下降。因此，本研究拟探讨去SUMO化酶Senp1是否参与Spop的蛋白水平调控，并在ccRCC中初步探索SENP1与SPOP之间的相关性，以期为ccRCC的治疗提供新的思路。

1、材料和方法

1.1 材料

WT和Senp1-/-MEFs由上海交通大学医学院程金科教授馈赠；肾上皮细胞HK⁃2和ccRCC细胞Caki⁃1、Caki⁃2、A498、786⁃O均购于武汉普诺赛公司；DMEM培养基、MEM培养基、RPMI⁃1640培养基、McCoy’s 5A培养基、胎牛血清、0.25%EDTA⁃胰蛋白酶（Gibco公司，美国）；青霉素/链霉素（苏州新赛美公司）；RNAiso Plus细胞总RNA提取试剂（TaKaRa公司，日本）；HiScriptⅡQ⁃RT SuperMix for qPCR(gDNA wiper）逆转录试剂盒及AceQ qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量PCR试剂盒（南京诺唯赞公司）；Duolink®PLA试剂盒（Sigma公司，美国）；转染质粒试剂PlusTMReagent(Thermo公司，美国）；Lamin B1、α⁃Tubulin、Spop、HA抗体（武汉三鹰）；Sumo1抗体（CST公司，美国）；c⁃Myc抗体（Sigma公司，美国）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch公司，美国）；MG132、放线菌酮（cycloheximide,CHX)(Sgima公司，美国）；Myc⁃Senp1、Flag⁃Spop、Flag⁃Spop⁃K95R、Flag⁃Spop⁃K110R、Flag⁃Spop⁃K95/110R质粒均为本实验室自行构建。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

WT和Senp1-/-MEFs使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，肾上皮细胞HK⁃2和ccRCC细胞A498使用含10%胎牛血清的MEM培养基，ccRCC细胞Caki⁃1和Caki⁃2使用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基，ccRCC细胞786⁃O使用含10%胎牛血清的RPMI⁃1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞转染

细胞汇合度达70%～80%时，加入质粒转染液，转染6～8 h后，换成正常的细胞培养液继续培养至36～48 h，提取细胞总RNA和总蛋白进行后续实验，或者是培养至一定时间，收集瞬时转染的细胞，进行后续的实验。

1.2.3 细胞总RNA和总蛋白的提取

细胞总RNA的提取：收集细胞，先将细胞用PBS清洗1遍，加入RNAiso Plus，冰上静置5 min，加入1/5体积的氯仿，4℃冰箱静置10 min,4℃12 000 g离心10 min。离心后，上清移至干净的RNase⁃Free离心管中，加入等体积异丙醇，混匀-20℃冰箱冷冻1 h,4℃12 000 g离心10 min，弃上清，加入75%乙醇（DEPC水配制），4℃12 000 g离心5 min，弃上清，4℃晾干10 min，加入10μL DEPC水，冰上溶解30 min，测定RNA浓度。

细胞总蛋白的提取：收集细胞，先将细胞用TBS清洗1～2遍，加入适量的RIPA裂解液，刮板快速刮下细胞，将裂解液收集于干净的1.5mL离心管中，冰上裂解15～30 min,4℃14 000 r/min离心20 min，离心后，将上清移至新的1.5 mL离心管中，吸取适量蛋白液进行BCA蛋白浓度的检测。加入相应体积的5×上样缓冲液，95℃煮5 min，使蛋白完全变性。

1.2.4 免疫印迹实验（Western blot)

制备好的蛋白样品常温14 000 r/min离心1 min，在SDS⁃PAGE胶上进行电泳。经湿转法恒压80 V，转膜2 h，脱脂牛奶室温封闭1 h，加一抗4℃过夜。次日，TBST洗膜3次，每次15～20 min。室温孵育二抗2 h，洗膜后化学发光显影。

1.2.5 实时荧光定量PCR

使用RNAiso提取细胞总RNA，逆转录试剂盒进行反转录，取10μL反转录产物稀释至100μL，取1μL做模板进行荧光定量PCR，软件Light Cycler 96分析数据。每个实验组有3个复孔，实验结果重复3次。引物序列：GAPDH上游5′⁃CGACCACTTTGT⁃CAAGCTCA⁃3′，下游5′⁃CCCTGTT GCTGTAGC⁃CAAAT⁃3′；Spop上游5′⁃CCACCTCCGGCAGAAAT⁃GTC⁃3′，下游5′⁃CCTCCCGGCAAAAACTAAAGT⁃3′。

1.2.6 邻位连接技术（proximity ligation assay,PLA)

细胞转染质粒24 h后，PBS清洗1遍，4%甲醛固定细胞，0.3%NP⁃40透化细胞，根据PLA试剂盒中的步骤进行封闭、一抗孵育、添加探针、连接、扩增、封片，最后用激光共聚焦显微镜进行拍照分析。

1.2.7 免疫荧光染色

细胞转染后24 h，将细胞接种于用0.1%明胶包被的细胞爬片上，继续培养24 h后，PBS清洗1遍，4%甲醛固定细胞，使用抗体稀释液（3%BSA、0.3%Triton X⁃100，溶于PBS)4℃下封闭并透化细胞1 h，之后4℃孵育一抗过夜。使用TBST清洗细胞2次，每次3～5min，之后室温条件下荧光二抗避光孵育1h，不同荧光二抗使用的稀释比例均为1∶200。TBST清洗细胞3次，每次3～5 min。最后使用封固剂（含DAPI）将细胞爬片固定在载玻片上。拍摄使用LSM900激光共聚焦显微镜图像，图像处理使用ZEN 3.0(blue edition）软件。

1.2.8 蛋白周转速率检测

细胞接种于6孔板，待细胞长满后，用终浓度为20μmol/L的蛋白合成抑制剂CHX分别处理细胞各种不同时间，在相应时间点，收取蛋白样品进行Western blot分析。

1.2.9 相关性分析

从GEO数据库中下载ccRCC患者的基因表达数据（GSE73731），利用GraphPad Prism 7.0对SENP1与SPOP的基因表达进行皮尔逊相关系数分析并作图。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0进行统计分析并作图。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组内比较采用重复测量数据的方差分析，两组间比较采用t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Senp1敲除下调Spop蛋白水平但不影响其mRNA水平

为了研究Senp1是否参与调控Spop，本研究提取了WT和Senp1-/-MEFs的RNA和蛋白，检测Senp1敲除对于Spop表达的影响。结果显示，Senp1敲除后，Spop的蛋白水平显著下降（图1A、B），但其mRNA水平没有明显变化（图1C）。由于Senp1是去SUMO化酶，所以上述结果提示Senp1可能参与了Spop的SUMO化修饰过程。

随后，为了进一步确认Senp1对Spop蛋白水平的调控作用，在Senp1-/-MEFs中梯度回补了Senp1蛋白。Western blot结果显示，随着Senp1蛋白水平的升高，Spop的蛋白水平也随之梯度升高（图1D），进一步说明去SUMO化酶Senp1能够调节Spop的蛋白水平。

2.2 Senp1敲除后Spop蛋白稳定性下降

通常认为，影响底物蛋白的降解速率，即蛋白周转率，是SUMO化修饰对底物蛋白进行调控的重要手段。为了检测Senp1是否影响Spop的蛋白周转率，利用CHX(20μmol/L）分别处理WT和Senp1-/-MEFs不同时间后检测细胞中Spop的蛋白水平。结果显示，Senp1-/-MEFs中的Spop含量下降到50%的时间要短于WT MEFs（图2A、B），表明Senp1敲除后，Spop的蛋白周转率变快，蛋白稳定性下降。

后续，为了研究Spop蛋白是否通过蛋白酶体途径降解，利用蛋白酶体抑制剂MG132(20μmol/L）处理Senp1-/-MEFs。WB结果显示，当用MG132抑制蛋白酶体活性后，细胞中的Spop有所升高（图2C),表明在Senp1-/-MEFs中Spop通过蛋白酶体途径降解。

2.3 Senp1不影响Spop的亚细胞定位

SUMO化修饰除影响底物蛋白的周转速率外，还可以调控底物蛋白在细胞中的定位[18]。研究表明，在ccRCC中SPOP错误定位在胞质中并大量累积，靶向与细胞增殖和凋亡有关的底物降解，导致肿瘤增生[15]。为了研究去SUMO化酶Senp1是否参与调控Spop的亚细胞定位，分离了WT和Senp1-/-MEFs的胞核蛋白和胞浆蛋白，并分别检测其中的Spop蛋白水平。Western blot结果显示，在WT MEFs中，Spop蛋白主要定位在细胞核中，仅有少量蛋白存在于胞浆中；Senp1-/-MEFs中Spop的分布情况与WT MEFs基本一致，表明Senp1的敲除并不影响Spop在细胞中的定位（图3A、B）。

图1 敲除Senp1下调Spop蛋白水平，但不影响其mRNA水平

图2 Senp1敲除后Spop蛋白稳定性下降

为了进一步确认上述结果，利用免疫荧光技术分别检测了内源Spop和外源Spop在WT和Senp1-/-MEFs中的定位情况。结果显示，在WT和Senp1-/-MEFs中，无论内源还是外源Spop的亚细胞定位都与胞核高度重合，进一步表明Senp1并不影响Spop在细胞核中的定位（图3C、D）。

2.4 Senp1通过参与Spop的去SUMO化修饰实现对Spop的蛋白调控

初步确定Senp1能够上调Spop的蛋白水平后，为了研究该过程是否通过影响Spop的SUMO化修饰实现，首先对Spop的氨基酸序列进行了分析，在其MATH结构域中发现了2个潜在的SUMO化修饰位点，分别是第95位和第110位的赖氨酸（图4A）。随后构建了单SUMO化位点突变质粒Flag⁃Spop⁃K95R、Flag⁃Spop⁃K110R和双SUMO化位点突变质粒Flag⁃Spop⁃K95/110R，并分别在WT和Senp1-/-MEFs中进行过表达。结果显示，当在Senp1-/-MEFs中过表达野生型Spop时，其蛋白表达量较WT MEFs减少，说明Senp1敲除后，Spop的SUMO化修饰增加，影响Spop的蛋白水平。而当在Senp1-/-MEFs中过表达Spop突变体时，即Spop不能进行SUMO化修饰时，其蛋白水平相比WT MEFs不再减少（图4B）。

图3 Senp1不影响Spop的亚细胞定位

2.5 SUMO化位点突变Spop与Sumo1在细胞核中结合变弱

为了进一步研究Spop蛋白的SUMO化修饰，分别在WT和Senp1-/-MEFs中共表达Sumo1和野生型Spop或其SUMO修饰位点的突变体，利用PLA实验检测Spop与Sumo1蛋白之间的相互作用（图5A）。统计结果显示，当细胞中存在Senp1蛋白时，与过表达的Flag⁃Spop蛋白相比，过表达的Flag⁃Spop⁃K110R蛋白和Flag⁃Spop⁃K95/110R蛋白与Sumo1蛋白的相互作用显著减少，表明K110位点的突变能够影响Spop与Sumo1的相互作用。进一步统计这些相互作用在胞质、胞核中的分布情况，结果显示，PLA阳性信号主要集中在胞核中，说明Spop蛋白主要在胞核中进行SUMO化修饰（图5B）。而当细胞中无Senp1蛋白时，野生型Spop与Sumo1的相互作用较WT MEFs有所下降，这可能是Senp1的缺失导致Spop蛋白稳定性下降，进而蛋白量减少所致；除此之外，和WT MEFs组一致，与过表达的Flag⁃Spop蛋白相比，过表达的Flag⁃Spop⁃K110R和Flag⁃Spop⁃K95/110R蛋白与Sumo1蛋白相互作用降低。有趣的是，Flag⁃Spop⁃K95R与Sumo1的相互作用在Senp1-/-MEFs中显著下降，推测这可能是因为一般情况下K95位点在Spop与Sumo1蛋白结合中的作用较小，需要在SUMO修饰大量存在的情况下，相互作用的微小变化才能显现出来。同样分别统计了PLA信号在Senp1-/-MEFs细胞中的分布情况，结果与WT MEFs组一致，SUMO化修饰后的Spop蛋白主要定位在胞核中（图5C）。

图4 Senp1通过参与Spop的SUMO化修饰实现对Spop的蛋白调控

2.6 SPOP和SENP1在肾癌中呈正相关

鉴于SPOP在ccRCC中高表达且具有核心作用，为了研究其高表达是否与去SUMO化修饰相关，首先利用GEO数据库中ccRCC患者的基因表达数据，对SPOP和SENP1在ccRCC患者中的表达进行了相关分析。结果表明，ccRCC患者的SPOP表达和SENP1表达呈明显的正相关关系（r=0.44,P<0.001，图6A）。同时，还检测了肾上皮细胞HK⁃2和ccRCC细胞Caki⁃1、Caki⁃2、A498、786⁃O中的SENP1和SPOP表达情况，ccRCC细胞中SPOP的蛋白水平高于正常肾上皮细胞。ccRCC细胞中SENP1的表达也比正常细胞多，与已有报道一致[16]，提示ccRCC中SPOP的表达可能受SENP1的调控（图6B）。

图5 SUMO化位点突变下调Spop与Sumo1的相互作用

3、讨论

肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）是泌尿系统中的常见恶性肿瘤之一。全世界每年约有20.9万人确诊RCC，约10.2万人死于该疾病[19]。ccRCC是RCC中最常见的病理亚型，约占75%[20]。大约30%的RCC患者在确诊时已经发生了癌细胞的转移[21]，未转移的RCC患者在进行手术切除治疗后，约40%会复发，并且RCC对放疗、化疗均不敏感，患者的5年生存率<10%[22]。因此探索RCC发病的分子机制，寻找RCC早期诊断和治疗的分子靶标迫在眉睫。

作为泛素连接酶E3家族成员Cul3结合底物蛋白的接头蛋白，SPOP介导许多底物蛋白的泛素化修饰，导致蛋白降解，从而参与细胞的多种进程。在ccRCC中，SPOP的异常高表达与低氧诱导因子（hypoxia inducible factor,HIF）密切相关，肿瘤内部的低氧微环境会活化HIF,SPOP作为HIF的下游靶基因被启动转录，SPOP错误定位在胞质中并大量累积，靶向与细胞增殖和凋亡有关的底物降解，最终导致肿瘤增生[15]。

蛋白的翻译后修饰对于蛋白行使功能具有重要作用，SUMO化修饰作为蛋白翻译后修饰的一种已被证实可以调控蛋白的活化、功能和亚细胞定位。近年来人们发现，参与SUMO化修饰的酶在肿瘤中存在异常表达，如在SPOP发生突变的前列腺癌患者中，去SUMO化酶SENP7呈现出高表达。SENP7通过减少异染色质蛋白1α(heterochromatin protein 1α,HP1α）的SUMO化修饰和沉默与HP1α相关的基因来延缓细胞衰老。抑癌因子SPOP突变后，失去诱导SENP7降解的能力，细胞过度增殖最终导致肿瘤发生[23]。

图6 SPOP和SENP1的表达在肾透明细胞癌中呈正相关

以上研究表明SPOP的SUMO化修饰过程可能在ccRCC中具有重要作用，但作为调控SUMO化修饰的关键分子之一，SENP1与SPOP之间的关系还不清楚。本研究发现，MEFs中去SUMO化酶Senp1参与Spop的表达调控，Senp1敲除后，Spop蛋白的稳定性下降并通过蛋白酶体途径降解，这一现象可能与Senp1敲除，改变Spop的SUMO化修饰状态有关。除此之外，还发现敲除Senp1后，Spop在MEFs细胞核中的定位并没有发生改变，说明Senp1可能并不参与调控Spop的亚细胞定位。另外，生物信息学分析和Western blot结果也表明，ccRCC患者的SPOP表达和SENP1表达呈明显的正相关关系，提示SPOP的表达在一定程度上受SENP1的调控。综上，SENP1可能成为ccRCC新的潜在治疗靶点。

基金资助:国家自然科学基金(81702747,82172629);

文章来源:张赟豪,韩博昂,王瑜,等.senp1在spop去sumo化修饰中的作用研究[j].南京医科大学学报(自然科学版),2024,44(06):753-761.