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鹧鸪源基因Ⅻ型新城疫病毒对SPF鸡致病性的研究

2023-11-20 101 上传者：管理员

摘要：为研究鹧鸪源基因Ⅻ型新城疫病毒(NDV)FP158对SPF鸡的致病性，测定了FP158的鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI),将FP158感染6周龄SPF鸡后，观察其临床症状，测定喉头和泄殖腔棉拭子中病毒的鸡胚半数感染量(EID50);感染后第3天随机处死3只鸡，观察其剖检病变，并采集内脏器官制备病理切片观察病理变化。结果显示，FP158的MDT为57 h, ICPI为1.65。SPF鸡在感染后第3天开始出现精神萎靡，排黄绿色稀便，轻微的呼吸道症状和轻微的神经症状，到第9天后症状逐渐消失。感染后SPF鸡喉头和泄殖腔排毒逐渐升高，至第3天达到高峰，后逐渐降低，至第13天检测不到排毒。剖检发现盲肠扁桃体出血，其他组织器官未发现明显病变。病理切片观察发现大脑局部神经元变性，嗜酸性增强；肺脏支气管黏膜水肿，大量炎细胞浸润，部分上皮细胞脱落，管腔充满炎性渗出物；盲肠扁桃体异嗜性细胞浸润。对照组SPF鸡临床表现正常，排毒检测为阴性，无剖检病变和组织病理学变化。研究结果表明，鹧鸪源基因Ⅻ型NDV能感染SPF鸡。

关键词：
人工感染
基因Ⅻ型新城疫病毒
排毒
新城疫
病理学
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新城疫(Newcastle disease, ND)是由副黏病毒科的新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种病毒性传染病，世界动物卫生组织(World organization for animal health, WOAH)将其列为必须通报的动物疫病，由于其病死率高，传染性强，给养禽业带来巨大经济损失[1,2]。NDV可感染250 多种家禽或鸟类 [3]。根据NDV 融合蛋白(fusion, F) 基因序列差异，可将毒株分为Ⅰ类(class Ⅰ)和Ⅱ类(class Ⅱ),其中class Ⅱ NDV包含Ⅰ～ⅩⅪ共20个基因型[4,5]。研究报道表明，在我国鸡、鸭、鹅和野鸟中主要流行毒株为基因Ⅶ型，鸽子的主要流行毒株为基因Ⅵ型[6,7,8,9]。基因Ⅻ型NDV,2004 年首次发现于秘鲁的鸡群，2010年后在我国广东和广西地区的鹅群中也分离到[10,11,12]。2016年，本实验室在对广西野生鸟类的NDV监测中，发现了鹧鸪源的基因Ⅻ(为Ⅻ.2亚型)型NDV,这是首次报道从我国野鸟中分离到基因Ⅻ型NDV[13]。为深入研究鹧鸪源基因Ⅻ型NDV对鸡的致病性，本研究将此基因Ⅻ型NDV感无特定病原体(specific pathogen free, SPF)鸡，观察其临床症状，采集喉头和泄殖腔拭子，通过测定拭子中病毒的鸡胚半数感染量(half infection of chicken embryo, EID50)来分析SPF鸡的排毒情况；处死SPF鸡观察剖检病变，采集SPF鸡的组织器官，通过制备病理切片分析感染后SPF鸡的病理变化，为基因Ⅻ型NDV的防控和临床诊断提供科学依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、阳性血清和实验动物

鹧鸪源基因Ⅻ型NDV(Francolinus pintadeanus158,FP158)的鸡胚尿囊液由本实验室分离、鉴定、纯化并保存[13]。鸡NDV标准阳性血清由本实验室制备并保存。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。SPF鸡为本实验室将SPF鸡胚孵化后饲养在SPF鸡隔离器中。

1.1.2 主要试剂

磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS),北京索莱宝科技有限公司产品；Gibco DMEM细胞培养液和胎牛血清，美国ThermoFisher Scientific公司产品。

1.1.3 主要仪器

孵化器(DZ47-63),山东泰昌孵化设备有限公司产品；二氧化碳培养箱(Forma Steri-Cycle),美国ThermoFisher Scientific公司产品；显微镜及成像设备(Ti2),日本Nikon公司产品；动物隔离器(FS-GY),苏州市冯氏实验动物设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒EID50、致死鸡胚平均死亡时间和脑内接种致病指数的测定

将FP158鸡胚尿囊液用灭菌PBS作连续的10倍倍比稀释(101～1011),取106～1011病毒稀释液接种9胚龄SPF鸡胚5个，每个鸡胚0.1 mL。37℃孵化，每日观察4次，收集24～96 h内的死胚和活胚尿囊液，进行HA试验检测效价，记录每个稀释度的感染数，按照Reed和Muench法[14]计算病毒的EID50。根据《GB/T 16550-2020新城疫诊断技术》[15]的步骤，使用SPF鸡胚/1日龄SPF雏鸡测定FP158鸡胚尿囊液的致死鸡胚平均死亡时间(mean death time of chicken embryos, MDT) 和脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index, ICPI),分析FP158的致病性。MDT的结果判定标准：强毒株，鸡胚平均致死时间小于60 h ;中等毒力毒株，鸡胚平均致死时间在60～90 h范围内；弱毒株，鸡胚平均致死时间大于90 h。ICPI的结果判定标准：ICPI值高于1.60者为速发型强毒株，1.20～1.60者为中发型，低于1.2者为缓发型。

1.2.2 FP158感染SPF鸡

将60只6周龄SPF鸡随机分为2组，感染组30只，对照组30只。感染组的SPF鸡每只滴鼻点眼106EID50 FP158,对照组接种相同剂量的无菌PBS。感染后每日观察SPF鸡的临床症状。在感染后第1、3、5、7、9、11、13、15天，感染组和对照组随机各抽取8只SPF鸡，采集咽喉和泄殖腔拭子，浸泡于DMEM细胞培养液中，充分捻动挤干拭子，1 500 r/min离心15 min, 取上清置-70℃冷冻保存用于EID50的测定。

另在感染后第3天，随机抽取感染组和对照组各3只SPF鸡处死，观察SPF鸡组织器官的病变情况，采集肝、脾、肾、肺、法氏囊、胰腺、腺胃、盲肠扁桃体和大脑，固定于10%中性福尔马林溶液中，用于制作病理切片。

1.2.3 SPF鸡的排毒检测

将咽喉拭子和泄殖腔拭子样品上清，用灭菌PBS作连续的10倍倍比稀释(101～106),按1.2中的方法测定咽喉拭子和泄殖腔拭子样品的EID50。

1.2.4 病理组织学观察

采集的组织器官于10%中性福尔马林溶液中固定24 h以上，采用不同浓度的酒精进行脱水、透明，封蜡后进行包埋，切片厚4～10 μm, HE染色后，脱水封片，显微镜观察组织切片的病理变化。

2、结果

2.1 EID50、MDT和ICPI的测定结果

对FP158鸡胚尿囊液，测定EID50、MDT和ICPI。试验结果显示，本试验使用的FP158 EID50为108.5/0.1 mL,MDT为57 h, ICPI为1.65。根据MDT和ICPI的判定标准，本试验使用的FP158为强毒株(表1-3)。

表1 FP158 EID50结果

2.2 FP158感染SPF鸡的临床症状及剖检变化

将FP158感染SPF鸡，观察其临床症状及剖检病变。结果显示，SPF鸡第3天开始出现微精神萎靡，排黄绿色稀便，轻微的呼吸道症状和轻微的神经症状，到第9天后症状逐渐消失，无死亡鸡只。对照组在整个试验过程中表现正常。感染组SPF鸡第3天后剖检发现盲肠扁桃体有出血，其他组织器官未发现肉眼可见病变。对照组剖检未发现组织器官有病变。说明FP158能引起SPF鸡出现临床症状和剖检变化。

表2 FP158 MDT结果

表3 FP158 ICPI结果

2.3 FP158感染SPF鸡的排毒测定结果

将FP158感染SPF鸡，采集咽喉和泄殖腔拭子进病毒的EID50测定。结果显示，1～11 d咽喉拭子和泄殖腔拭子中均可以连续检测到病毒，咽喉拭子的病毒量比泄殖腔拭子的稍高一些，并且在9 d和11 d咽喉拭子的病毒检出率比泄殖腔拭子高。咽喉和泄殖腔1～15 d的整体排毒趋势较为一致，在感染后第3天咽喉和泄殖腔的排毒均达到最大值，咽喉和泄殖腔拭子的病毒载量高达104.83EID50/0.1 mL和104.5EID50/0.1mL,感染第5天后排毒量开始逐渐下降，到第11天时排毒量已经很低，到第13天和第15天检测不到病毒(图1)。对照组拭子未检测到病毒。说明FP158能在SPF鸡中复制并排毒。

2.4 FP158感染SPF鸡的病理学变化观察结果

将FP158感染SPF鸡，采集内脏器官制备病理切片，观察SPF鸡的病理变化。结果显示，大脑、肺脏和盲肠扁桃体均出现明显的病理学变化，其它组织器官未出现明显病理学变化。感染第3天后，大脑局部神经元变性，嗜酸性增强(图2A);肺脏支气管黏膜水肿，大量炎细胞浸润，部分上皮细胞脱落，管腔充满炎性渗出物(图2B);盲肠扁桃体出血，异嗜性细胞浸润(图2C)。对照组SPF鸡各组织均未见明显异常(图2a-c)。结果表明，FP158能引起SPF鸡的组织器官出现病理变化。

图1 FP158感染SPF鸡排毒的测定结果

3、讨论

NDV分离株F蛋白裂解能力是判断毒力的标准之一[16],强毒株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成是112R/K-R-Q-K/R-R-F117,而弱毒株相对应的氨基酸组成是112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117 [17,18]。近年，本实验室从广西野生鸟类鹧鸪中分离到基因Ⅻ型NDV FP158,经测序分析，其F蛋白氨基酸裂解位点基序为112 R-R-Q-K-R-F 117,符合NDV强毒株的典型特征[13],并且MDT和ICPI致病指数的测定结果也显示，分离株致病力为强毒株。当前使用的NDV疫苗主要为基因Ⅶ、Ⅱ和Ⅰ型[19],鉴于FP158为野生鸟类鹧鸪源及其符合强毒株的特征，并且广西丰富的鸟类资源存在向家禽排毒致病的危险，因此本研究将FP158人工感染SPF鸡，观察其对SPF鸡的致病情况，为基因Ⅻ型NDV的防控和临床诊断提供科学依据。

图2 FP158感染SPF鸡的组织病理学变化（感染后第3天）（H-E 200×）

基因Ⅻ型NDV目前有基因Ⅻ.1和Ⅻ.2和Ⅻ.4等亚型。但据报道，南美基因Ⅻ.1型和越南基因Ⅻ.4型NDV分离株，均对鸡表现出强毒致病性[20,21],南美基因Ⅻ.1型NDV分离株，肉鸡死亡率为4%～12%,且表现呼吸困难等症状，蛋鸡表现为轻微呼吸困难，减蛋，死亡率为1.8%,其中孔雀分离株以102 PFU剂量可100%致死非免疫鸡；越南基因Ⅻ.4型NDV分离株攻毒鸡只后也表现精神沉郁，腺胃乳头出血等症状和病变。

Xiang等[22]发现，广东省鹅源基因Ⅻ.2型NDV分离株E115,感染非免疫鸡表现出临床症状如轻微精神沉郁，扭头瘫痪等神经症状，但不致死，并且症状随着时间逐渐减轻可耐过。本研究中的鹧鸪源基因Ⅻ.2型NDV FP158感染SPF鸡后，出现精神萎靡，拉黄绿色稀便，轻微的呼吸道症状和轻微的神经症状，到第9天后症状逐渐消失，无死亡鸡只，表现的临床症状与广东省鹅源基因Ⅻ.2型NDV分离株E115相似。剖检发现，感染FP158的SPF鸡，盲肠扁桃体有严重出血，其他组织器官未发现肉眼可见病变。病理切片结果也显示盲肠扁桃体有广泛的异嗜性细胞浸润。FP158的F蛋白裂解位点序列符合强毒株特征，但对鸡的临床致病性并不非常严重。我国分离的基因Ⅻ.2型NDV,无论是家禽源还是野鸟源的分离株，对鸡的临床致病性都不是非常严重，说明NDV的致病力主要还是和基因型相关。另外，南美鸡源Ⅻ.1型NDV分离株和越南鸡源Ⅻ.4型NDV分离株，感染鸡后剖检出现新城疫的典型症状如腺胃乳头出血[20,21]。而在我国广东和广西分离的鹅源基因Ⅻ.2型NDV分离株[22],感染鸡后剖检并无明显病变。这些基因Ⅻ型NDV分离株，与本团队分离的鹧鸪源基因Ⅻ.2型新城疫病毒FP158感染后剖检症状(盲肠扁桃体出血严重)明显不同。推测本团队分离的FP158对SPF鸡盲肠扁桃体有组织嗜性，这还有待进一步的研究。

本研究中，SPF鸡感染FP158后，1～11 d咽喉拭子和泄殖腔拭子中均可以连续检测到病毒，咽喉拭子和泄殖腔整体排毒趋势较为一致，表明SPF鸡在感染后可通过呼吸道和泄殖腔这两种方式进行排毒。在感染后第3天咽喉和泄殖腔的排毒均达到最大值，咽喉和泄殖腔拭子的病毒载量高达104.83EID50/0.1mL和104.5EID50/0.1mL,在感染的SPF鸡排毒量最高的时候，组织病理学结果也显示，感染的SPF鸡出现大脑局部神经元变性，肺脏支气管大量炎细胞浸润，盲肠扁桃体出现广泛的异嗜性细胞浸润。感染的SPF鸡临床症状和剖检变化，与排毒变化也基本相对应。本研究为基因Ⅻ型NDV的防控和临床诊断提供了科学依据，为今后深入研究基因Ⅻ型NDV的致病机制奠定了基础。

参考文献:

[2]谢丽基,谢芝勋,罗思思,等.2017年广西地区活禽市场新城疫病原学监测与遗传进化分析[J].中国预防兽医学报,2018,40(08):747-750.

[9]曾婷婷,谢丽基,谢芝勋,等.2018年广西7种鸟类的新城疫病毒病原学监测和F基因遗传进化分析[J].中国兽医杂志,2020,56(12):9-13.

[11]刘华雷,吕艳,王静静,等.我国新出现基因Ⅻ型新城疫病毒的分布及特性[J].中国动物检疫,2017,34(9):1-3.

[12]曾婷婷,谢芝勋,华俊,等.2株广西鹅源基因Ⅻ型新城疫病毒的病原学分析[J].南方农业学报,2022,53(07):2007-2014.

[13]谢丽基,谢芝勋,罗思思,等.2016-2017年广西4种野生鸟类新城疫病原学检测与遗传进化分析[J].中国动物检疫,2018,35(05):21-24+50.

[18]刘涛,吉艳红,贾艳娥,等.反向遗传技术致弱的基因Ⅶ型新城疫病毒对SPF鸡的免疫效力评价[J].中国预防兽医学报,2017,39(06):475-480.

[19]赵怡倩,赵跃祺,吴慧芳,等.我国家禽新城疫病毒流行基因型分析[J].动物医学进展,2022,43(3):107-111.

基金资助:广西科技重点研发项目(桂科AB16380054);广西八桂学者专项(2019A50);

文章来源:曾婷婷,谢丽基,谢芝勋等.鹧鸪源基因Ⅻ型新城疫病毒对SPF鸡致病性的研究[J].动物医学进展,2023,44(11):53-58.