家禽是冷应激敏感动物，过低的温度会影响家禽的生长发育，我国北方气候多严寒，常会引起家禽的冷应激，冷应激反应机制十分复杂，能影响机体的抗氧化系统，涉及到很多组织器官，主要表现为影响家禽的生长发育，造成免疫力下降，表现为肉鸡生长缓慢、发病率高及死亡率高等[1,2,3,4]。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)其主要成分为黄酮类、萜类内酯类、羧酸类等其他物质，药理作用主要包括抗氧化、清除自由基、减轻脂质过氧化、抗肿瘤、增加血液循环、保护神经系统等作用[5,6,7,8]。银杏叶提取物具有非常强的抗氧化能力，可改善肉鸡的生长性能，提高机体免疫力[9]。宋学立报道，氧化应激是冷应激对Wistar乳鼠心肌细胞损伤原因之一[10],王中晓报道，银杏叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注造成的氧化损伤具有保护作用[11],提示GBE对冷应激导致机体的氧化损伤有保护作用，而银杏树在我国分布广泛，种植量大，银杏叶提取GBE具有很高的经济效益。刀豆素(concanavalinA,ConA)是一种由刀豆植物中提取的凝集素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，能选择性激活抑制性T细胞(Ts细胞),对调节机体免疫反应具有重要作用。本试验使用HE染色、免疫组织化学等方法对冷应激肉鸡心脏、肝脏的病理损伤及IL-6和HSP90的表达进行了分析，探讨了GBE联合ConA对冷应激肉鸡的保护作用，为进一步研究中草药添加剂对肉鸡生产经济效益的提升提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物

1日龄AA肉鸡，购自河南省实验动物中心。

1.1.2 主要试剂

银杏叶提取物(GBE),大板生药株式会社有限公司产品；促益康每瓶5 g, 含ConA≥5 mg, 江苏南京农大动物药业有限公司产品；IL-6抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司产品；HSP90抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司产品；HE染色试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司产品；免疫组化试剂盒DAB显色剂，武汉赛维尔生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备

石蜡切片机，徕卡仪器(德国)有限公司产品；恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；显微镜，日本奥林巴斯公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

选1日龄AA肉鸡饲养至21日龄时，随机分为5组，分别为空白对照组(TN)、冷应激组(cold stress, CS)和3个给药组，给药组分别为低浓度组200 mg/kg GBE+50 mg/kg ConA(CS200),中浓度组400 mg/kg GBE+50 mg/kg ConA(CS400),高浓度组600 mg/kg GBE+50 mg/kg ConA(CS600),每组10只，每组单笼饲养，试验期7d, TN组温度控制在28±1℃,其余4组均进行冷应激处理，冷应急模型参照刘晓丹[12]的模型建立，每天7:00～21:00温度为28℃±1℃,每天21:00～7:00温度为20℃±1℃,鸡舍相对湿度为55%～60%,试验期间各组均自由采食、饮水。

1.2.2 取材及切片

饲养试验结束后，每组随机选取3羽进行取材，于上午9:00采用断颈法处死，随后迅速采集心脏、肝脏组织置于10%福尔马林固定液中固定12 h～24 h, 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做连续切片，片厚5 μm, 隔3取3,共制备3套切片，一套行HE染色以作阳性细胞定位，一套用于阴性对照，一套用于免疫组化染色。

1.2.3 免疫组化操作程序

一抗为IL-6多克隆抗体(工作浓度1∶100),阴性对照采用0.01 mol/L PBS缓冲液代替一抗，按如下程序进行：①切片脱蜡复水，经pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸抗原修复液热抗原修复。②每张切片加1滴(约50 μL)过氧化酶阻断溶液(A液),室温下孵育10 min, PBS冲洗3次，每次3 min。③除去PBS液，每张切片加1滴(约50 μL)正常非免疫动物血清(B液),室温下孵育10 min。④除去血清，每张切片加1滴(约50 μL) IL-6抗体，室温下孵育60 min或4℃过夜。⑤PBS冲洗3次，每次5 min。除去PBS液，每张切片加1滴(约50 μL)生物素标记的第二抗体(C液),室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。⑥除去PBS液，每张切片加1滴(约50 μL)链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(D液),室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。⑦除去PBS液，每张切片加2滴(约100 μL)新鲜配置的DAB溶液，室温静置10 min, 显微镜下观察。⑧自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。⑨梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照组切片染色把IL-6抗体用PBS液代替，其余步骤完全相同。HSP90免疫组织化学染色把IL-6抗体换做HSP90抗体，操作同上。

1.2.4 结果观察及数据统计分析

随机在切片中选取5个部位相同但切片不同的高倍镜视野(40×),用Image pro plus软件对图片进行分析，计算所观察切片的每个视野中阳性细胞的阳性强度均值(阳性强度的结果用平均吸光度表示)最后计算出阳性产物的相对表达量u2均值(即u2=阳性强度均值×阳性面积×光镜倍数/963 030),其中963 030表示像素[13],计量的结果用平均值标准差(Mean±SD)表示，数据用SPSS21统计分析软件进行分析统计，采用单因素方差分析比较各试验组肉鸡心脏、肝脏中IL-6及HSP90的表达，P<0.05为差异有显著的统计学意义，P<0.01为差异有极显著的统计学意义。

2、结果

2.1 GBE联合ConA对冷应激肉鸡心肌形态结构的影响

利用HE染色方法观察冷应激对肉鸡心肌细胞的损伤作用。果显示，TN组在正常温度下，心肌纤维较细，排列整齐、纹理清晰，无心肌纤维断裂现象；处理组在冷应激条件下，CS组部分心肌纤维增粗，心肌间距变宽，心肌纤维断裂及水样变性；CS200组、CS400组、CS600组与CS组相比均有不同程度缓和。CS200组可观察到部分心肌间距变宽，心肌纤维断裂；CS400组可观察到大部分心肌纤维较细，排列整齐、纹理清晰，部分心肌纤维间距变宽，偶见心肌纤维断裂；CS600组可观察到心肌纤维较细，排列整齐、纹理清晰，部分心肌纤维间距变宽，最接近正常对照组TN组(图1)。

图1 各组鸡心肌组织显微结构图像(40×)   

2.2 GBE联合ConA对冷应激肉鸡肝组织形态的影响

利用HE染色方法观察冷应激对肉鸡肝组织形态的影响，结果显示，TN组在正常温度下，肝细胞边界明显，排列较为整齐，无明显变性；在冷应激下，CS组肝细胞边界不明显，排列紊乱，有空泡样变；CS200组、CS400组、CS600组与CS组相比均有不同程度缓和。CS200组可观察到少部分空泡样变，较CS组已经有所减轻，肝细胞形态较为完整；CS400组可观察到大部分肝细胞形态完整，几乎无空泡样变；CS600组可观察到肝细胞边界明显，排列较为整齐，无明显空泡变性最接近正常对照组TN组(图2)。

图2 各组鸡肝脏组织显微结构图像(40×)   

2.3 GBE联合ConA对IL-6在冷应激肉鸡心脏、肝脏中表达的影响

各组肉鸡心脏、肝脏组织IL-6表达呈现较强的细胞质染色，阳性染色差异强度见表1。与CS组相比，GBE联合ConA各试验组肉鸡心脏IL-6表达量均下调，但GBE联合ConA各试验组与TN组相比，无显著性差异，其中CS600组与TN组最为接近。GBE联合ConA各试验组与CS组相比，肝脏IL-6表达量均下调，差异极显著(P<0.01),CS200组IL-6表达量低于CS400、CS600两组，差异显著(P<0.05),与TN组无显著性差异。CS600组心脏、肝脏IL-6的表达与TN组最为接近。

图3 各组鸡心脏组织IL-6免疫组化图(40×)   

图4 各组鸡肝脏组织IL-6免疫组化图(40×)   

2.4 GBE联合ConA对冷应激肉鸡心脏、肝脏HSP90表达的影响

各组肉鸡心脏、肝脏组织HSP90表达呈现较强的细胞质染色，阳性染色强度差异见表2,与TN组相比，CS组心脏HSP90的相对表达量下调，差异极显著(P<0.01),与CS组相比，CS600组HSP90表达量显著上调，差异极显著(P<0.01),CS200组与CS400组未出现显著性差异，GBE联合ConA各试验组与TN组相比未出现显著性差异；肝脏HSP90表达量中，CS组与其他4组相比，HSP90表达量显著上调，差异极显著(P<0.01),CS200组与其他4组相比表达量显著下调，差异极显著(P<0.01)。CS400组、CS600组与TN组无显著差异，其中CS600组与TN组最为接近。

表1 GBE联合ConA对冷应激肉鸡心脏、肝脏IL-6表达的影响

表2 GBE联合ConA对冷应激肉鸡心脏、肝脏HSP90表达的影响

图5 各组鸡心脏组织HSP90免疫组化图(40×)   

图6 各组鸡肝脏组织HSP90免疫组化图(40×)   

3、讨论

冷应激机制十分复杂，几乎涉及到全身所有器官。大量研究表明，冷应激反应会导致动物的交感-肾上腺髓质系统兴奋，进而引起心率加快，心脏收缩力变强，持续性的冷应激，会因外周小动脉的收缩而致使微循环血液灌流量减少，最终导致心率失常、心功能不全，甚至导致循环衰竭、休克和重要器官的机能障碍等危害[12]。本研究显示，CS组大部分心肌纤维增粗，细胞核明显，突出可见，核膜和染色质固缩，染色加深，心肌间距变宽，心肌纤维断裂现象明显，中草药添加剂对冷应激具有明显的保护作用，其中CS600保护效果最好。在消化系统中，冷应激主要导致消化道溃疡，也称为应激性溃疡(SU)。有研究表明，由冷应激所引起的SU的发生率可高达80%～100%[14]。李鹏等研究表明，冷应激条件下大鼠肝脏发生了空泡样脂肪变性[15],研究显示，冷应激下，CS组肉鸡心肌间距变宽，心肌纤维断裂；肝细胞边界不明显，排列紊乱，有空泡样变。添加中草药添加剂后，CS600组心肌纤维排列整齐、纹理清晰；肝细胞空泡减少，细胞边界明显。结果表明，GBE联合ConA对冷应激诱导的肉鸡心肌、肝细胞损伤有一定的保护作用。

急性冷应激刺激常呈现免疫抑制，而慢性冷应激及温和冷应激常引起免疫增强，重度冷应激引起免疫下降[16]。IL-6是Th2细胞分泌，参与介导体液免疫功能，炎症和感染时生成和释放增加，参与机体的防御功能，研究指出，在非炎性应激时，机体内IL-6水平增加，生物活性增强。Hangalapura B N等报道冷应激可以增高IL-6的水平[17],刘亚莉等报道束缚冷水应激可引起血清中IL-6升高[18]。本研究显示，慢性冷应激肉鸡心脏、肝脏组织IL-6的表达升高，而GBE联合ConA可以调控机体免疫能力，从而调控IL-6的表达，尤其CS600组，与对照组相比表达最为接近。结果表明，GBE联合ConA可以有效抑制应激时IL-6的生成，避免剧烈炎症反应或持续性炎症反应对机体带来有害损伤。热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是细胞抵抗不良环境影响的重要保护性蛋白，多种应激均能诱导HSPs的表达[19,20,21,22]。HSP90家族基因具有高度保守性，是一类ATP依赖的分子伴侣，在维持蛋白构型稳定、激素受体稳定及蛋白降解和免疫调节过程中发挥着重要作用[23,24],应激状态下产生的HSP90发挥分子伴侣作用，维持蛋白原的构象和功能，促进错误蛋白质降解，并将蛋白质移位至线粒体、内质网内发挥作用，对防止应激引起的细胞损害及受损恢复方面起着重要作用[25,26,27]。赵福庆报道，急、慢性冷应激时各组织中HSP90表达量整体呈增加趋势，但心脏在HSP90表达量在急慢性冷应激时均降低。结果表明，热应激蛋白(HSP)在各组织器官中表达水平不同，反映了各组织器官在冷应激反应中的不同调节作用[28]。张子威等研究表明，急、慢性冷应激使得肝脏中HSP90表达量增加，机体可通过HSP途径抵抗冷应激对肉鸡造成的肝损伤[23]。本研究结果显示，慢性冷应激会抑制心脏组织HSP90的表达，给药后能上调HSP90在心脏中的表达；慢性冷应激会提高肝脏组织HSP90的表达，给药后可下调HSP90的表达，这表明肉鸡在遭受冷应激后，HSP90在不同器官中的调节作用是不同的，当肉鸡遭受冷应激时，维持HSP90在机体内相对稳定的表达具有一定意义。

综上所述，GBE联合ConA可能通过调控冷应激诱导的炎症反应，发挥对心脏和肝脏的保护作用，其机制可能GBE与ConA的对IL-6和HSP90调节功能有关。

参考文献:

[3]李如兰.浅析寒冷应激对鸡的影响 [J].当代畜禽养殖业,2010,(3):3-5.

[4]袁施彬,何平.家禽冷应激及其营养调控研究进展 [J].中国畜禽种业,2008,4(8):55-58.

[6]程秋月,郭菁,张成义.黄酮类化合物药理作用的研究 [J].北华大学学报:自然科学版,2011,12(2):4.

[7]刘顺良,张喜旺,郭翠英.银杏叶开发应用研究现状 [J].中国药业,2001,10(5):2.

[8]王飞娟.银杏叶中黄酮类化合物的研究进展 [J].西北药学杂志,2010,25(002):155-156.

[9]任小杰.银杏叶及其提取物对肉鸡生产性能､抗氧化指标和免疫性能的影响 [D];山东农业大学,2018.

[10]宋学立,钱令嘉,李风芝.冷应激对心肌细胞损伤的影响 [J].解放军预防医学杂志,2001,19(2):88-91.

[11]王中晓.银杏叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 [J].中医临床研究,2014,(17):10-1.

[12]刘晓丹.肉鸡冷应激相关基因的mRNA表达谱分析及差异表达基因的研究 [D];东北农业大学,2012.

[13]司丽芳,陈树林,李健,等.IFN-γ对流产大鼠子宫及卵巢IL-18表达和外周血IL-18水平的影响 [Z].中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会第十八次学术研讨会论文集.南京.2014:281-288.

[14]冷慧.催产素经VTA-NAc DA信号通路对大鼠应激性胃溃疡的保护作用及潜在机制研究 [D];青岛大学,2020.

[15]李鹏,杨焕民,任宝波,等.冷应激大鼠几种组织形态结构变化的研究 [J].黑龙江八一农垦大学学报,2004,16(2):5.

[16]邱家祥,米克热木·沙衣布扎提,赵红琼.家禽冷应激研究进展 [J].动物医学进展,2008,29(3):96-101.

基金资助:国家自然科学基金项目(31401209);河南科技大学校企合作重大合作项目(20220133);动物营养调控与健康安徽省重点实验室基金项目(APKLANRH202004);

文章来源:王飞耀,司丽芳,李梦云等.银杏叶提取物联合刀豆素A对冷应激肉鸡心肌和肝脏组织IL-6和HSP90表达的影响[J].动物医学进展,2023,44(11):72-77.