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鸡源SAMHD1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

2024-01-16 82 上传者：管理员

摘要：为制备鸡源宿主限制因子SAMHD1(chSAMHD1)的多克隆抗体，本试验根据chSAMHD1基因序列设计引物，扩增部分chSAMHD1片段，构建p ET-chSAMHD1原核表达质粒，并将其转化至BL21(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导和镍柱亲和层析纯化获得重组chSAMHD1蛋白。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗chSAMHD1多克隆抗体，通过Westernblot和IFA测定多克隆抗体的反应性。结果显示，chSAMHD1重组蛋白的相对分子质量约为75.0 k Da，与预期大小一致；重组蛋白以包涵体形式表达；所制备的chSAMHD1多克隆抗体效价达到1:512 000;IFA结果证实，本试验所制备多克隆抗体能够特异性识别DF-1细胞中过表达的chSAMHD1蛋白。以上结果表明，该研究成功制备了chSAMHD1蛋白多克隆抗体，从而为鸡源SAMHD1蛋白功能的深入研究奠定了基础。

关键词：
不育α基序和组氨酸/天冬氨酸蛋白
多克隆抗体
无菌α基序（SAM）
核酸酶活性
鸡源SAMHD1
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不育α基序和组氨酸/天冬氨酸蛋白（Sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domaincontaining protein 1,SAMHD1）于2000年被首次发现，该蛋白主要存在于免疫细胞，如单核细胞和树突状细胞中[1]。SAMHD1蛋白由无菌α基序（SAM）结构域和组氨酸-天冬氨酸（HD）结构域构成，前者负责蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用，后者则具有蛋白磷酸水解酶和核酸酶活性[2]。SAMHD1蛋白从原核生物到真核生物均保守存在，该蛋白广泛参与了细胞周期调控、细胞稳态维持、DNA损伤应答、免疫反应调节等过程，具有多种生物学功能[3]。

近年来的研究表明，作为一种重要的先天免疫限制因子，SAMHD1还可以抑制反转录病毒的增殖、降低抗病毒免疫反应和炎症反应[4,5]。SAMHD1能够调控细胞内的d NTP含量，从而抑制包括人类免疫缺陷病毒（HIV）在内的多种逆转录病毒的感染[1]，如猫免疫缺陷病毒（FIV）、小鼠白血病病毒（Mu LV）、马传染性贫血病毒（EIAV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）等[6]。此外，SAMHD1也可以抑制某些DNA病毒在宿主细胞中的复制，如单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和痘病毒[7]。

SAMHD1蛋白具有种属特异性，猪源及马属动物源SAMHD1已被证实具有抗病毒活性[8,9]。鸡源SAMHD1(ch SAMHD1）基因位于鸡基因组第20号染色体，编码614个氨基酸，与人SAMHD1蛋白同源性仅有60%左右，其生物学功能尚不清楚。本试验首先将ch SAMHD1的HD结构域克隆至p ET32a（+）载体，构建原核表达质粒，并在BL2(DE3）大肠杆菌中诱导表达；随后将重组蛋白免疫SPF级6周龄BALB/c小鼠制备抗ch SAMHD1多克隆抗体，并对所制备的多克隆抗体的反应性进行鉴定，从而为ch SAMHD1生物学功能的深入研究奠定基础。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化试剂盒购自广州飞扬生物工程有限公司；常规限制性内切酶Eco RⅠ、Xho I、T4 DNA连接酶、Prime Script™One Step RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α和BL21(DE3）感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）及FITC荧光素标记的山羊抗鼠Ig G购自北京全式金生物技术有限公司；镍预装柱购自金斯瑞生物科技有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。

1.1.2 实验动物

SPF级BALB/c小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司；原核表达载体p ET-32a（+）和鸡胚成纤维细胞系DF-1由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 ch SAMHD1基因扩增及重组质粒构建

根据ch SAMHD1基因序列（Gen Bank登录号：NM＿001030845.2）设计引物，扩增ch SAMHD1基因HD结构域（开放阅读框第301-1 845 nt）序列。上游引物ch SAMHD1-F:5′-GAATTCATGCA GACAGCAGACATCATGA-3′，下游引物ch SA MHD1-R:5′-GTCGACTTACTTATTGAAAGAG AGCT-3′，在上、下游引物的5′端分别引入Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点。提取鸡淋巴细胞RNA，通过RT-PCR扩增ch SAMHD1基因序列。反应体系为：Prime Script One Step Enzyme Mix 2μL,2×Buffer 25μL，上下游引物（10μM）各1μL,RNA 4μL,RNase-Free d H2O 17μL。反应程序为：50℃反转录30 min,94℃2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min,4℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，并用回收试剂盒进行切胶纯化。

1.2.2 p ET-ch SAMHD1原核表达质粒的构建

使用限制性内切酶Eco RⅠ和SalⅠ分别酶切p ET-32a（+）载体和ch SAMHD1扩增片段，并用胶回收试剂盒纯化相应的酶切产物。使用T4 DNA连接酶连接后转化至DH5α大肠杆菌，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送北京擎科生物科技有限公司进行测序。验证正确的提取质粒（命名为p ET-ch SAMHD1），置于-20℃保存、备用。

1.2.3 chSAMHD1重组蛋白的诱导表达及纯化

将p ET-chSAMHD1转化至BL21(DE3）大肠杆菌，挑取单克隆菌落接种于5 mL LB培养基中培养过夜。第二天取出其中1 mL菌液转接于200 mL LB培养基，于37℃，200 r/min培养至OD600约为0.6时，加入IPTG诱导表达（终浓度为0.1 mmol/L),32℃继续培养6 h。随后12 000 r/min离心10 min收集菌体，使用10 mLPBS重悬后超声破碎，分别将上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的表达形式。使用镍柱进行蛋白纯化，分别用6、4、2 mol/L浓度的尿素和PBS缓冲液透析。BCA法定量后分装，置于-80℃保存。

1.2.4 ch SAMHD1重组蛋白的Western blot鉴定

将纯化的ch SAMHD1重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，加入1%的BSA封闭1h；弃封闭液，加入1:500倍稀释的鼠抗His抗体，4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜；然后加入1:1 000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠Ig G二抗，室温孵育1 h,TBST缓冲液洗膜；最后加入显影液，通过成像系统测定ch SAMHD1重组蛋白与抗His抗体的反应性。

1.2.5 ch SAMHD1蛋白多克隆抗体的制备

将纯化的ch SAMHD1重组蛋白与弗式完全佐剂乳化后（体积比1:1），采用背部皮下注射的方式免疫5只SPF级6周龄BALB/c小鼠，每只免疫100μg。2周后，用ch SAMHD1重组蛋白与弗式不完全佐剂乳化后加强免疫（体积比1:1);2周后，以同样的方式进行三免。三免10 d后断尾采血并分离收集血清，分装后置于-20℃保存。

1.2.6 chSAMHD1多克隆抗体效价的测定

通过间接ELISA测定chSAMHD1多克隆抗体效价。将重组chSAMHD1蛋白包被ELISA板（0.1μg/孔），4℃孵育过夜；加入5%脱脂奶粉封闭1 h；将制备的chSAMHD1多克隆抗体以1:1 000～1:512 000稀释，加入到反应板中(100μL/孔），37℃孵育1 h,PBST洗涤3次；加入1:2 000稀释的HRP标记的羊抗鼠Ig G(100μL/孔），37℃孵育1 h,PBST洗涤3次；加入100μL TMB底物显色液（100μL/孔），37℃反应5 min后加入2 mol/L H2SO4(100μL/孔）终止反应；使用酶标仪测定OD450值，以OD值≥0.21为临界值，计算效价。

1.2.7 间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体反应性

将ch SAMHD1真核表达质粒pc DNA-ch SAMHD1转染至DF-1;36 h后，用4%多聚甲醛室温固定10 min,PBS洗5次；加入1:100倍稀释的鼠抗ch SAMHD1多克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗5次；加入FITC标记的山羊抗鼠Ig G二抗，37℃孵育1 h,PBS洗5次，通过荧光显微镜进行观察。

2、结果

2.1 ch SAMHD1原核表达质粒的构建

提取鸡淋巴细胞RNA,RT-PCR扩增部分ch SAMHD1基因序列，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果表明成功扩增到与预期大小接近的目的片段（图1）。将目的片段克隆至p ET-32a（+）载体，对构建的p ET-ch SAMHD1质粒进行双酶切鉴定，结果可见1 545 bp（目的基因）和6 000 bp（载体）两个条带（图2）。挑取阳性克隆进行测序验证，结果显示所扩增的序列与理论序列同源性为100%，无点突变发生。

图1 部分ch SAMHD1基因的扩增

图2 p ET-SAMHD1质粒的双酶切验证

2.2 ch SAMHD1重组蛋白的诱导表达与纯化

将p ET-ch SAMHD1质粒转化至BL21(DE3）大肠杆菌，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并分析蛋白可溶性。SDS-PAGE电泳结果显示，ch SAMHD1重组蛋白约75.0 k Da，与预期大小一致，且目的蛋白主要以包涵体形式表达（图3）。经Ni柱纯化后，可见单一目的条带（图4），表明所制备的ch SAMHD1重组蛋白纯度较高。

2.3 ch SAMHD1重组蛋白的反应原性鉴定

将纯化的ch SAMHD1重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，通过Western blot分析蛋白的反应原性。结果表明，重组ch SAMHD1蛋白可以与抗His抗体发生特异性反应（图5）。

图3 ch SAMHD1蛋白的表达分析

图4 ch SAMHD1蛋白的纯化分析。

图5 纯化蛋白的Western blot鉴定

2.4 ch SAMHD1多克隆抗体的制备及抗体效价测定

将纯化的重组ch SAMHD1蛋白用弗氏佐剂乳化后免疫6周龄BALB/c小鼠，三免后收集血清，采用间接ELISA测定多克隆抗体效价。结果表明，本试验所制备的抗ch SAMHD1多克隆抗体的抗体效价可达1:256 000，可满足后续试验需求。

2.5 ch SAMHD1多克隆抗体反应性的IFA鉴定

将ch SAMHD1真核表达质粒pc DNA-ch SAMHD1转染DF-1细胞，以1:100稀释的ch SAMHD1多克隆抗体作为一抗进行IFA试验。结果显示，抗ch SAMHD1多克隆抗体能够与转染真核表达质粒的DF-1发生特异性反应，表明该抗体具有良好的反应性（图6）。

图6 多克隆抗体对真核表达ch SAMHD1蛋白的IFA检测A.使用多克隆抗体检测转染pc DNA-ch SAMHD1的细胞；B.使用阴性小鼠血清检测转染pc DNA-ch SAMHD1的细胞；C.使用多克隆抗体检测转染pc DNA3.1空质粒细胞。

3、讨论与结论

SAMHD1是一种在多种物种中广泛表达的脱氧核苷酸三磷酸水解酶（d NTPase），该蛋白由无菌α基序（SAM）结构域和组氨酸-天冬氨酸（HD）结构域组成。一般认为，SAM结构域介导蛋白质与蛋白质或蛋白质与核酸的相互作用，而HD结构域则发挥d NTPase活性[3]。SAMHD1可形成四聚体，这种寡聚作用是其催化d NTPase活性所必需的。SAMHD1可将d NTP转化为脱氧核苷和三磷酸盐，从而抵消d NTP的从头合成[6]。

近年来的研究表明，SAMHD1是一种可对抗多种病毒的宿主限制因子。研究人员最早在非增殖性髓系细胞如巨噬细胞和树突状细胞中发现SAMHD1可抑制HIV-1的复制[1,2,3]。由于HIV-1等反转录病毒需要以前病毒c DNA的形式将其整合到宿主基因组中，因此反转录病毒需要较高的细胞内d NTP水平进行逆转录。在非分裂细胞中，SAMHD1通过下调细胞内d NTP的浓度来限制病毒的复制[10]。除了HIV-1,SAMHD1也可以抑制乙型肝炎病毒（HBV）、人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）、痘病毒等DNA病毒的复制。对于不同病毒，SAMHD1可以通过不同的机制发挥抗病毒功能。HBV通过RNA中间体和逆转录步骤复制其病毒DNA基因组，因此SAMHD1的d NTPase活性可以有效地限制细胞中HBV DNA的复制[11]。此外，SAMHD1可直接结合NF-κB，阻断NF-κB与病毒启动子的结合，从而抑制HCMV早期基因的表达，进而抑制病毒复制[12]。

在不同物种中，SAMHD1也具有一定的抗病毒作用。如猪源SAMHD1可以通过抑制RNA的合成来抑制猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）。但是，关于鸡源SAMHD1蛋白的功能、作用及调控机制的报道较少。研究发现，ch SAMHD1与人SAMHD1蛋白同源性约62%，具有与人SAMHD1蛋白类似的结构组成，并且ch SAMHD1同样具有d NTP水解酶和核酸酶活性[13]，由此推测ch SAMHD1可能具有抗病毒作用。然而，目前缺乏商业化的ch SAMHD1抗体，这限制了对ch SAMHD1功能的研究。因此制备ch SAMHD1多克隆抗体对于研究ch SAMHD1蛋白抗病毒功能和机制具有重要意义。

经蛋白理化性质预测，ch SAMHD1的SAM结构域不适于大肠杆菌原核表达系统的表达。因此，本试验选择ch SAMHD1的HD结构域进行原核表达，并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体。本试验首先构建了p ET-ch SAMHD1原核表达质粒，可溶性分析表明ch SAMHD1蛋白以包涵体的形式表达。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ch SAMHD1蛋白的多克隆抗体，间接ELISA方法测定本研究制备的多抗效价可以达到1:256 000以上，可以满足后续试验的需求。本试验所制备的ch SAMHD1多克隆抗体为后期蛋白抗病毒功能的研究奠定了基础。

参考文献:

[8]郭苗苗,尹鑫,姚秋成,等.稳定表达马属动物SAMHD1蛋白的U937细胞系的建立及其抗病毒活性初步研究[J].中国预防兽医学报, 2017, 39(10):5.

[9]杨莘,姜一峰,虞凌雪,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白与天然免疫限制因子SAMHD1相互作用的分析与鉴定[C].中国畜牧兽医学会生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会论文集. 2016.

[13]贺双意,孔佳,王媚媚,等.猪和鸡源SAMHD1蛋白的酶活性研究[J].天津大学学报(自然科学与工程技术版), 2018,51(1):9.

基金资助:山东省自然科学基金面上项目(ZR2019MC045);

文章来源:王一新,张真研,曹凤阳等.鸡源SAMHD1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定[J].山东畜牧兽医,2024,45(01):30-34.