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浅谈用显微镜观察家蚕胚胎发育中的组织形态变化

2020-03-03 623 上传者：管理员

摘要：通过石蜡切片法，对家蚕许多重要器官与性状发育进行了观察，并在光学显微镜下进行观察与拍照，以探明家蚕胚胎发育过程中重要外部形态器官的发育及与时间关系。实验对卵裂与胚盘形成期、胚带形成期、器官形成期和完成期整个过程进行跟踪记录，并对时间进行记录，为家蚕个体发育，器官的形成与分化进行深入研究提供了依据。

关键词：
卵裂期
器官形成
石蜡切片
胚动
胚带形成期
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家蚕是重要的经济昆虫，也是遗传学上的一种重要模式昆虫。家蚕的胚胎发育过程包括许多生长发育关键时期，例如:性别决定、器官分化与发育等。对这些关键时期的研究不仅是研究整个家蚕发育生物学前提条件，也对蚕种生产实践有指导意义。国内外不少昆虫学家、生物学家对家蚕胚胎发育的形态学和组织学进行了比较多的深入研究。他们的研究较多在胚胎学和组织学的观察与描述，以文字描述、示意图、手绘图来展示家蚕的胚胎发育过程，不能直观地反映家蚕胚胎发育的外部和内部组织形态(Nagyetal.，1994；向仲怀，2005；吕鸿声，2011)。后来又采用石蜡切片加苏木精－伊红染色的方法进一步地改进了家蚕胚胎发育的直观图，但这些直观图又缺少相对应的胚胎发育时间刻度(吴维光，1999；柴春利和鲁成，2006；潘敏慧等，2007；徐伟，2007)。因此本文通过改进的石蜡切片技术结合家蚕各胚胎发育时刻进行解剖，并在光学显微镜下进行观察与拍照，以探明家蚕胚胎发育过程中重要外部形态器官的发育及与时间关系。

1、材料与方法

家蚕Bombyxmori为华南农业大学动物科学学院提供，非滞育系。在25℃、相对湿度70%的人工气候箱中培养。首先准备足够多的家蚕卵，放入25℃恒温培养箱里。先每隔10min，30min、1h取出部分卵进行固定。后面每隔4－24h固定一批卵，直到幼虫孵化为止。取不同发育时期的蚕卵进行组织形态学的观察研究。家蚕胚胎石蜡切制作用酒精硼砂洋红染色法进行部分进改(利翠英，1961；徐伟，2007)。

家蚕卵先用Carnoy固定液固定12－24h后，转入70%乙醇溶液中保存。加入微量次氯酸钠氧化卵壳，直到卵壳变薄并呈半透明状，稍显胚胎位置时，先置于酒精硼砂洋红染色液中或盐酸洋红染色24h，然后移入盐酸酒精中，直至组织中不再渗出红色为止。然后用50%－100%酒精逐级洗涤数次，最后一次用松油醇蜡洗涤后将胚胎浸入60℃石蜡中包埋1h，在Leica切片机上进行切片，厚度为3－5μm。切片取出后在水中展平，用鸡蛋清与甘油1∶1配成的混合液作为贴片剂，均匀涂在载玻片上，用镊子小心将以上的切片粘在载玻片上置于45℃下脱蜡干燥。接着用二甲苯∶100%酒精(1∶1)－50%酒精逐级复水，然后用伊红二次染色。再经过50%－100%乙醇脱水后用二甲苯进行透明10min，中性树进行封片。然后在显微镜(型号:EVOSFL)可见光明场(brightfield)下观察，拍照。

2、结果与分析

家蚕的胚胎发育起始于受精卵核的分裂和移动以及细胞质的移动。导致建立至少3种主要的核系:胚盘、极细胞和卵黄细胞核。

2.1 卵裂与胚盘形成期

自精卵受精后，合核分裂约发生在产卵后2h。合核在适应的条件下发育，呈同步指数分裂，形成许多卵裂核散布在卵黄内(见图1A)。刚开始合核分裂发生在卵的中部，在分裂后期，子核向周质扩期，逐渐接近卵的表层(见图1B)，进而达到周质与之合成一体，形成单层细胞层逐渐形成胚盘或胚膜。

图1家蚕胚胎发育的卵裂期

2.2 胚带形成期

由单层细胞组成的胚盘与卵腹侧的细胞相接，不断增厚形成胚带，两端离开卵膜向内部弯曲，胚胎发育到28h，出现了染色较深的原肠化胚(图2A)。图2示原肠化后胚胎发育28h至36h的连续变化过程。随着胚胎的不断增殖，胚胎开始伸长和分节(图2B)，32h能看到明显的原头(图2C)。胚胎发至约36h，这时是身体的最长时期，已经开始有口孔和肛陷，进一步发育为消化系统。头胸部突起明显，可以分为颚节和胸节(图2D)，并进一步在第3天左右进发育为头部和胸部。

2.3 器官形成期

如图3A所示，胚胎发育至72h检查其为缩短期。之后，在胚体可见上唇突起、触肢突起、上颚突起和胸足突起，第一腹节与胸节分离明显，并有气门原孔。至92h发育为反转期。胚胎已经有了头、胸、腹的分化，上颚突起，体表有气门，腹足突起。反转期是昆虫胚胎发育中一个特殊的胚动过程，因此也产生了第1次蜕皮。由图3A的胸足和腹足紧贴卵壳转变为图3B、3C、3D胸足和腹足被躯干所包围。通过胚动，昆虫可以调整身体的位置，以方便将卵里的营养全部吸收，供给胚胎发育所需要的营养。图3C显示为胚胎发育至142h的组织形态特征。外部形态来看，口器中上颚明显，胸部的胸足、腹部的腹足及臀足明显。从解剖生理组织来看，由外胚层内陷和中胚层发育而成的消化系统明显，口器(腔)－嗉囔－胃盲囊－中肠－直肠－直肠垫－肛门开口都能明显地看到。图3D显示为胚胎发育至190h，胚胎头部可看到单眼明显，体表有蜕皮及少量刚毛。

图2家蚕胚胎发育原肠化后胚胎发育28－36h的连续变化过程；图3家蚕胚胎发育的器官形成期

2.4 完成期

家蚕胚胎发育至214h，各种器官已经发育完成(图4)，部分还经历了多次蜕皮，在胚胎里能看到残蜕。平均在第10天的时候，蚁蚕孵化。

图4家蚕胚胎发育完成期

3、结论与讨论

卵裂和胚盘的形成期是家蚕整个胚胎发育最初始时期，又是时间最短暂的时期，一般在产卵后2h开始。屠振力等(2014)对着色非滞育系的家蚕进行显微镜经过观察发现，经过了精核与卵核结合成为受精核，2h40min观察到2个分裂核。这个时期是一个非常关键的时期，尤其以RNA干扰为手段进行基因功能分析的实验，显微注射应在产卵后2h内进行。在产卵后14h能看到完整的胚盘，15h就能观察到胚带的形成(Nagyetal.，1994)。胚带的形成期一般为产卵后的15－48h内。胚带的形成期的早期是原肠胚的形成，家蚕的滞育发生原肠胚后期阶段(Nakagakietal.，1991；刘玫静等，2014)。家蚕卵的滞育由母代所受到的温度和光照所决定(Sasibhushanetal.，2013)。虽然在滞育的卵中，磷酸果糖激酶总体是比非滞育的卵要高，但在非滞育卵中，产卵后6h就开始高度表达磷酸果糖激酶；而滞育卵中磷酸果糖激酶是低水平表达(Ponnuveletal.，2010)。在产卵后18－30h内，非滞育品系分别有1136与595个基因上调(18h和30h)，滞育品系有638和675个基因上调(Sasibhushanetal.，2013)。这些基因的表达差异，都反映胚带形成期发生的各种生理反应。

经过一段时间的发育，胚带形成期的胚胎外表形态分节，但还不具备成形的器官。中胚层的内陷在这个时期形成。中胚层的发育为研究肌肉和各种生理系统等功能提供基础。在胚带形成期的后期，胚胎明显分节，各种外部器官(上唇、触肢、上颚)开始形成。

器官形成期为胚胎发育的72－214h。器官发生与形成期是从神经沟出现到各种结节的出现为止(孵化前的3d)。自神经沟出现后，胚胎外表能先观察到上唇、触须、胸足和腹足的突起。在产卵后3d，能看到胚胎明显变短，这个时期为缩短期。这个时期为上唇的出现在结节出现前4d(Lietal.，2010)。

与果蝇(Drosophilamelanogaster和D.suzukii)的整个胚胎发育历程(分别为21h和23h30min)相比(Steponkusetal.，1990；Landietal.，2015)，家蚕的胚胎发育历期较长(240h)。三者的器官形成期占整个发育历程的比例在三者中相当(66.4%~67.4%)。但是，家蚕卵裂与胚盘形成期占整个发育历程的时间比果蝇所经历比例时间较少(约7.0%)，而果蝇这个时期的比例较大(约17.0%)。这可能与两者的早期发育模式差异较大有差(Nagyetal.，1994)。在原肠化前，家蚕的合子核分裂，然后迁移至卵周，再向卵腹部聚集。而果蝇卵裂核均匀迁移至卵质中，原生殖细胞则迁移至卵后极，最后发育为生殖腺(徐伟，2007)。

林良冠,何晓芳.家蚕胚胎发育过程的组织形态显微观察[J].环境昆虫学报,2019,41(1):215-219.