哺乳动物的牙齿发育是一个复杂的生物学过程。传统的发育生物学研究采用原位杂交、免疫组化、蛋白印迹等技术，侧重于从整个组织范围内鉴定单一基因的表达情况。随着高通量测序技术的发展，转录组测序广泛应用于测定和描绘各类物种的基因或转录本的表达情况。但这一技术是基于一群细胞或者组织，最终反映的是基因在整体中的平均表达水平，从而掩盖了不同细胞之间的表达异质性。在组织水平上，牙齿由不同胚层来源的组织在结构和功能上有序组合而成。外胚层来源的牙釉质和中胚层来源的牙本质、牙髓等组织在发育的过程中相互诱导，最终构建为结构完整、功能完全的器官。介导跨胚层互作的信号分子通过从信号发出细胞分泌，并作用于靶细胞处的受体，从而引发下游生物学效应，通过对该过程的细致解析，有助于深入阐释牙齿发育的生物学机制。

单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术蓬勃发展，从而在单细胞水平上揭示全基因组范围内所有基因的表达情况，有利于研究细胞间的表达异质性[1,2]。近年来，有研究利用scRNA-seq揭示牙齿发育期间独特的生物学现象和分子机制，尤其是不同细胞亚群之间跨胚层的信号传递和细胞互作，故本文将对这些新进展进行阐释。

1、scRNA-seq

传统的转录组测序研究需要投入较大量的材料，且无法识别细胞的异质性。为解决此问题，Tang等[3]首次报道scRNA-seq技术，通过在试管里手动操作移液，能够提取单个细胞的转录本进行分析。Islam等[4]通过加入单细胞条形码技术，同时对上万个细胞的转录本进行逆转录，构建测序文库。Ramskold等[5]通过改进逆转录酶和技术流程，使得逆转录的cDNA长度有所增加，覆盖绝大多数转录物的全长。

目前，一些基于液滴微流控技术的单细胞测序方案进一步增加了scRNA-seq的通量。在这类技术中，条形码DNA被用来标记液滴中的每个细胞。细胞裂解、cDNA合成等步骤均在液滴中进行，随后通过PCR扩增cDNA[6,7]。目前这一技术流程已商业化，且广泛应用于发育生物学等领域。

2、基于scRNA-seq绘制牙齿发育期间的细胞图谱

牙齿是一个多胚层来源、多细胞类型、结构复杂的器官。以往的胚胎学研究表明，上皮来源的牙板与其下方的致密间充质相互诱导形成牙体组织，最终上皮分化为成釉细胞，而间充质团块分化为牙本质和牙髓。最新的基于scRNA-seq的研究表明，牙齿的细胞构成十分复杂。

2.1牙髓中的细胞亚群

Pagella等[8]通过对人磨牙牙髓中分离得到的32 378个细胞进行scRNA-seq,根据已被报道的各类细胞标志物鉴定出了包括间充质干细胞、成纤维细胞、成牙本质细胞、内皮细胞、施万细胞、类上皮细胞、红细胞、免疫细胞等在内的15个细胞群。Hermans等[9]整合多个小鼠和人类的单细胞数据库，绘制分群更细的牙齿单细胞图谱。Jing等[10]通过对小鼠胚胎期第13.5天(embryonic 13.5th day, E13.5)蕾状期、E14.5帽状期以及E16.5钟状期等时间点的磨牙牙胚进行scRNA-seq,鉴定出在磨牙发育阶段具有重要功能的配对框基因9(paired box gene 9,PAX9)+和LIM同源框蛋白6(LIM homeobox domain 6,LHX6)+两个牙髓间充质干细胞群。

通过在细胞分群的基础上结合免疫组化技术，解析出不同细胞亚群在空间上的分布。利用这一手段，有学者鉴定出卷曲同源相关蛋白(frizzled-related protein, FRZB)、NOTCH同源物3(NOTCH homolog 3,NOTCH3)、胸腺细胞抗原1(thymus cell antigen 1,THY1)及肌球蛋白重链(myosin heavy polypeptide, MYH)11高表达的牙髓间充质干细胞群[8]。这一群细胞为间充质细胞的亚群，且分布于血小板内皮细胞黏附分子(platelet/endothelial cell adhesion molecule 1,Pecam1/CD31)标记的血管内皮细胞周围；除此之外，牙髓内亦有高表达角质素14(keratin 14,KRT14)以及分层蛋白(stratifin, SFN)的类上皮细胞群[8]。Wang等[11]结合谱系示踪表明，在成牙本质细胞外层，间充质来源的小细胞肺癌4簇抗原(small cell lung carcinoma cluster 4 antigen, CD24)+/胎盘特异基因8(placenta-specific 8,PLAC8)+细胞群能在特定空间位置上诱导牙齿模式发生。

2.2牙乳头细胞亚群

牙体组织内的某些细胞亚群具有与其他部位相同的干性标记。牙乳头侧的细胞群具有瘦素受体(leptin receptor, LEPR)标志物，这一基因同时也作为长骨内的骨髓间充质干细胞的干性标记[10]。而在不同时期的追踪结果显示，LEPR+的牙乳头细胞仅存续在磨牙发育中期，其未来的命运是分化为牙周膜成纤维细胞和牙骨质细胞。而Nagata等[12]结合体内追踪和scRNA-seq显示，甲状旁腺素相关肽(parathyroid hormone-like peptide, PTHRP)+的牙乳头细胞在甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)信号的影响下增殖，并分化为牙周膜成纤维细胞。Hu等[13]则鉴定出根尖牙乳头处的干细胞龛，这一群细胞具有MSH同源蛋白1(MSH homeobox 1,MSX1)+/SRY盒转录因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)+标记，并能在离体的情况下与上皮细胞相互诱导，形成类器官样的牙齿结构。

2.3切牙上皮细胞亚群

除磨牙外，小鼠切牙也常被作为研究对象进行牙齿发育的研究。Chiba等[14]通过对小鼠切牙中分离得到的6 260个细胞进行scRNA-seq,发现切牙中广泛存在多个细胞群，包括KRT14+的上皮干细胞龛、波形蛋白(vimentin, VIM)+/纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)+的间充质细胞群、钙黏蛋白5(cadherin 5,CDH5)+的内皮细胞以及CXC趋化因子配体12(CXC motif chemokine ligand 12,CCL12)+白细胞等。结合组织学的分析显示，切牙中的上皮细胞即为成釉细胞；通过拟时序分析，小鼠切牙中的上皮细胞分化轨迹得到解析：这部分细胞由T框转录因子1(T-box transcription factor 1,TBX1)+的祖细胞启动分化，进而成为牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)+和成釉蛋白(ameloblastin, AMBN)+的成釉细胞[14],从而构成切牙上皮。

2.4牙周膜细胞亚群

对人牙周膜的scRNA-seq数据表明，牙周膜具有上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、血管内皮细胞等细胞群。其中，牙周膜中的间充质细胞群组成较为复杂，多种转录因子或其他分子作为其细胞亚群的标志物。Pagella等[8]鉴定出MYH+牙周膜干细胞群，且使用拟时序分析牙周膜干细胞从MYH+到THY1+的发育轨迹，以及后续的成纤维细胞向分化。Takada等[15]研究发现莫霍克同源框(mohawk homeobox, MKX)+牙周膜干细胞能够进一步转化为成纤维细胞，其缺失将导致牙周膜发育障碍及牙周炎症水平升高。牙周膜的间充质干细胞亦具有独特的胶原蛋白编码基因的高表达模式，呈现出与牙髓间充质干细胞不同的基因表达特征[12]。牙周膜的部分成纤维细胞亚群高表达富半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白(boneγ-carboxyglutamate protein, BGLAP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)等基因，呈现出与成骨细胞相似的特征，参与牙骨质的形成与牙根发育[8]。

3、跨胚层细胞间信号

哺乳动物的牙齿发育起源于胚胎发育中期牙板下方间充质聚集、浓缩，进而诱导其上部的外胚层增厚并内陷，形成牙胚。之后，包括成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、音猬因子(sonic hedgehog, SHH)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)2、WNT等在内的分子信号以及机械力等信号，在牙齿发育的各个阶段建立局部或跨胚层分泌模式并相互干涉，影响后续牙体组织的进一步分化和功能形成。通过scRNA-seq结合传统的谱系追踪等手段，进一步揭示这些跨胚层信号的发送和接收过程的分子机制。

3.1 FGF信号

FGF是发育生物学中的一个经典生长调控信号，具有多种分子亚型，分别参与多种组织及器官的生长发育调控过程，例如四肢、毛囊、颅颌面结构等[16]。FGF信号调节许多细胞生物学过程，包括细胞增殖、分化、细胞黏附和运动[17]。FGF在颅颌面发育早期建立分泌模式，维持跨胚层浓度梯度，从而引导颅颌面不断向外部膨大[18]。而在FGF浓度梯度建立的同时，另一个由视黄酸(retinoic acid, RA)沿着头-尾轴建立的浓度梯度与FGF带来的生物学效应产生拮抗作用，进而使该轴向的头颈部细胞命运产生差异，逐渐形成特异的颅颌面结构[19]。

在细胞层面，FGF信号可分别由外胚层来源的细胞以及中胚层来源的细胞分泌，并作用于邻近的细胞群，影响相关细胞群的生物学特性。FGF信号主要参与成纤维细胞增殖和间充质祖细胞的成骨向分化。小鼠牙齿的scRNA-seq数据表明，高表达Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、组织金属蛋白酶抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3,TIMP3)、成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)的牙周膜细胞与成骨分化密切相关[13]。另外，施万细胞与牙髓中的其他细胞亚群具有广泛的FGF-FGFR1配体-受体互作[20]。在组织层面，FGF3能够作为牙乳头细胞的标志物，这一细胞群能够在小鼠磨牙发育中晚期分化为牙髓细胞以及成牙本质细胞，进而诱导牙根尖形成[10]。另外，单细胞的细胞分群及基因表达热图显示，FGF家族基因与增殖标志物Ki-67的表达具有高相关性，说明FGF信号广泛参与细胞增殖[10]。

3.2 SHH信号

SHH同样在哺乳动物胚胎发育中扮演重要角色。颅颌面包括唇、颚、唾液腺、舌在内的多种组织器官，其发育均受SHH调控[21]。在牙齿发育过程中，SHH主要在牙齿上皮中表达，从成牙上皮形成直到牙根形态发生，几乎贯穿整个过程[22]。SHH是牙齿发育的中心信号之一，调控牙齿各个成分的分化，包括牙釉质、牙本质、牙骨质和牙周软组织[23]。在刺猬(hedgehog, HH)通路中，细胞表面的HH受体——修补蛋白(patched, PTC),在接受SHH信号之后立马解除对平滑蛋白(smoothened, SMO)的抑制状态，进而释放GLI家族锌指蛋白1(GLI family zinc finger protein 1,GLI1)入核，从而激活其控制的靶基因转录。

在口腔组织自我修复和更新的稳态维持过程中，SHH信号仍具有一定贡献。目前，牙齿发育相关研究表明，GLI1(SHH信号的下游转录因子)阳性的牙齿间充质细胞具有自我更新、增殖与分化的干细胞特性，并且成熟牙齿中的GLI1+有助于牙髓和牙周组织再生[24,25]。

3.3 BMP信号

BMP属于转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β超家族，在发育中的胚胎表达广泛，并对生物体的发育至关重要。与TGF-β超家族的其他成员一样，BMP信号通过激活1个Ⅱ型跨膜丝氨酸-苏氨酸激酶受体与3种Ⅰ型受体(BMP1A、BMP1B和激活素受体样激酶2)的异二聚体复合物，从而转导进入细胞[26]。在细胞质中，主要由SMAD响应受体激活信号并磷酸化SMAD1/5/8,接着进入细胞核，作为转录因子以调节基因表达[27]。在哺乳动物牙齿发育过程中，包括BMP2、3、4和7在内的多个BMP基因在上皮或间充质中广泛表达[28,29]。另外，BMP活性与牙齿形成部位和牙齿类型的确定、牙齿萌出等生物学过程有关[29,30]。

BMP信号调控牙本质和牙根的形成。Shi等[31]通过对人第三磨牙scRNA-seq数据进行分析，发现成牙BMP-FGFR1-MSX1信号轴调控根尖牙乳头干细胞的增殖。同时，通过在不同发育阶段的磨牙单细胞图谱中分选出根尖牙乳头细胞亚群，并进行单独的聚类分析，发现根尖牙乳头细胞高表达BMP2,这也证实了BMP信号在牙根形成中的功能[10]。

3.4 WNT信号

WNT信号通路由WNT经典信号(WNT/β-catenin)和非经典信号通路组成，包含多个WNT配体及其下游转录因子(包括β-catenin)。WNT在牙齿间充质中分泌，其下游转录因子在牙囊细胞中广泛表达[32]。早期研究发现，阻断WNT信号能够阻止牙齿形成，并且在成骨细胞和成牙本质细胞中敲除β-catenin将导致牙根牙本质和牙骨质的畸形；相反，β-catenin的过表达同样将导致牙齿发育畸形、磨牙根变短、牙本质变薄及矿化度降低，同时导致牙齿萌出异常[33]。因此，在牙齿发育过程中WNT信号的表达量及表达时期至关重要。

WNT信号主要介导牙齿发育过程中的上皮-间充质互作。scRNA-seq表明，牙齿内以及牙周的许多上皮细胞亚群分泌WNT家族的相关蛋白，并诱导邻近的间充质细胞进行分化。牙周膜的类上皮细胞亚群高表达滤泡树突细胞分泌蛋白(follicular dendritic cell secreted protein, FDCSP)及WNT10A,从而影响间充质细胞增殖和成骨向分化[13]。除此之外，根尖牙乳头细胞及成牙骨质细胞也能分泌多种WNT配体，参与牙根尖发育。

3.5力学信号

近年来，对于力学信号控制牙齿发育及牙齿-牙周改建和稳态的机制研究逐步深入。在发育阶段，力学信号与其他控制牙齿发育的经典分子信号具有广泛的交互作用。通过对猪恒牙萌出的研究，Wu等[34]发现乳牙脱落的过程解除了恒牙上方的机械力作用，从而促进恒牙萌出。在这一过程中，未萌出恒牙上方的间充质内RUNX2-WNT信号显著下调，而恒牙上皮的WNT信号上调，从而推动牙齿萌出。在细胞内，力学信号的传递亦能通过影响miRNA的合成来调控基因表达[35]。通过对牙周膜细胞进行应力加载，发现力学刺激影响miRNA-29b的表达及下游胶原蛋白编码基因的转录水平，并且拉伸力和压力信号所造成的miRNA表达水平变化正好相反[36]。

4、总 结

牙齿的发育过程本质上是在多种信号分子的影响下，不同胚层细胞发生细胞命运转变，形成一个功能上相互依赖的器官。牙齿发育涉及多个细胞类型的分化和相互作用，包括上皮细胞、间充质细胞、神经细胞等。scRNA-seq技术通过对不同发育阶段的牙齿组织进行分离和分析，从而揭示各个细胞类型的转录组特征和在牙齿发育过程中的功能和相互关系。近年来新鉴定出的细胞亚群已整理在表1。在未来，通过把scRNA-seq技术与其他新技术结合，如空间转录组、单细胞染色质构象捕获以及其他高通量测序技术，将能更加深入、系统地阐释基因表达的各个层面对牙齿发育的影响。这些对发育生物学相关信号及精细的分子生物学作用机制的理解将有助于颅颌面创伤修复和口腔再生医学技术的发展。

表1根据scRNA-seq技术所鉴定出的牙齿细胞亚群

文章来源:张仲,袁泉.跨胚层细胞间信号调控牙齿发育的研究进展[J].口腔生物医学,2024,15(02):113-117.