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磷酸化聚酰胺-胺交联胶原蛋白支架体内成骨能力初探

2024-06-19 37 上传者：管理员

摘要：目的:探究磷酸化聚酰胺-胺(P-PAMAM)树状大分子交联胶原蛋白支架在体内成骨效能。方法:通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)对P-PAMAM进行表征，扫描电镜对胶原蛋白支架、聚酰胺-胺(PAMAM)复合胶原蛋白支架及P-PAMAM复合胶原蛋白支架进行形态表征。将3种复合支架植入SD大鼠颅骨骨缺损后，使用Micro-CT三维重建分析骨愈合过程中骨质、骨量的变化，采用HE染色及Masson染色对大鼠颅骨标本进行组织学分析。结果:FTIR显示PAMAM被成功磷酸化；扫描电镜显示，复合支架均具有良好的孔隙；体内成骨实验显示，与胶原蛋白支架和PAMAM复合胶原蛋白支架相比，P-PAMAM复合胶原蛋白支架具有更好的成骨诱导作用。结论:P-PAMAM树状大分子复合胶原蛋白支架在体内具有促进成骨作用。

关键词：
成骨
支架
牙髓病
磷酸化聚酰胺-胺
胶原蛋白
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根管治疗是牙髓病的有效治疗方法之一，但治疗后可能出现再感染、牙齿变色甚至牙折。为了弥补根管治疗的缺陷，牙本质-牙髓再生治疗应运而生，且随着组织工程学而飞速发展。作为组织工程的重要组成部分，支架材料的开发是牙本质-牙髓组织再生治疗研究的必然趋势。胶原蛋白(collagen, COL)是一种天然的细胞外基质，为组织提供结构支持，可作为细胞识别和结合的天然底物，促进不同类型细胞的黏附和生长[1,2]。因其来源丰富、易于纯化、生物相容性好、可在体内吸收、易与功能基团修饰等优点[3,4],被广泛作为组织工程和再生医学制造领域的支架材料。但是，COL支架机械强度差、弹性低及体内降解快的缺点，限制了其在临床中的进一步应用[5,6]。聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)树状分子俗称“人工蛋白质”,是理想的COL支架中的交联剂。其末端含有大量可变的官能团，可以作为传感器与不同靶分子结合，达到特定的靶向能力[7]。PAMAM分子广泛应用于多种领域，包括基因传递[8]、肿瘤治疗[9]、药物载体[10]、试剂转染[11]等。有研究显示，将PAMAM分子末端阳离子氨基取代为带负电荷的磷酸基团[12],从而将PAMAM分子转化为磷酸化的PAMAM(phosphorylated polyamidoamine, P-PAMAM)分子，可以模拟非胶原蛋白中磷酸化蛋白的功能，在一定程度上可以复制牙本质非胶原蛋白的功能，在组织工程的牙本质构建方面具有一定的应用前景[13]。因此，我们设想将P-PAMAM分子交联到COL支架上，并验证三维环境下复合支架的成骨作用，为研制新型盖髓剂用于临床活髓保存治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1实验动物与材料

30只10周龄雄性SD大鼠购自南京医科大学动物实验中心，体质量(300±50)g,饲养于南京医科大学动物实验基地，并获得南京医科大学动物管理与使用委员会的伦理批准(IACUC-2307040)。G3.0 PAMAM树状分子(山东威海晨源化工),苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒、Masson染色试剂盒(北京索莱宝),亚磷酸、Ⅰ 型胶原蛋白(COL1)粉(上海金环)。傅里叶变换红外光谱仪(fourier transform infrared spectrometer, FTIR)(Labconco,美国),扫描电镜(LEO 1530VP,德国),微电机颅骨钻(深圳瑞沃德),Micro-CT(SCANCO Medical AG,瑞士)。

1.2方法

1.2.1 P-PAMAM的制备

圆底烧瓶中置入500 mg亚磷酸和1 mL浓度为500 mg/mL G3.0 PAMAM树状大分子水溶液，加入5.8 mL去离子水及2.5 mL浓盐酸，加热至40℃,静置30 min,滴入710μL 40%(w/v)甲醛溶液，在40℃下维持2 h,用25%(w/v)氢氧化钠溶液中和，将其装入透析袋中持续透析2 d。使用FTIR对P-PAMAM进行表征。

1.2.2复合支架的制备及形态表征

制备3组支架，分别为单纯胶原蛋白支架(COL)组、PAMAM复合胶原蛋白支架(PAMAM+COL)组、P-PAMAM复合胶原蛋白支架(P-PAMAM+COL)组。3组支架制备方法如下：首先将COL1粉溶解于0.1 mol/L醋酸中，按1 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基卡巴朴胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC)、0.5 mg/mL N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)加入交联剂，调节pH为5.5,在PAMAM+COL组及P-PAMAM+COL组分别以1∶10比例分别加入PAMAM及P-PAMAM,置入孔板中，3组支架材料均需要梯度冷冻24 h,继而冻干48 h,抽真空度达0.01 Pa,置于4℃冰箱待用。使用扫描电子显微镜对3组支架的表面形貌进行表征。

1.2.3颅骨缺损模型植入支架材料

选取30只雄性SD大鼠，随机分为3组，每组10只。术前使用3%戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉后呈俯卧位，将其固定于手术台上。用手术刀片在SD大鼠颅骨中线切开2.5 mm皮肤切口，分离皮下组织及骨膜等。用微电机颅骨钻在骨中线两边分别钻直径约为5 mm的圆形骨缺损，分别植入1.2.2中制备的相对应的3组支架材料，伤口冲洗后缝合，麻醉苏醒后继续笼中饲养8周。术后8周处死大鼠，将其颅骨取下，置于4%多聚甲醛固定备用。

1.2.4 Micro-CT三维重建分析

将取出的颅骨在4%多聚甲醛中固定1周后，对颅骨外侧面进行Micro-CT检测，通过三维重建软件将扫描数据进行重建并对骨体积(bone volume, BV)、新生骨量与缺损总体积的比值(bone volume/total volume, BV/TV)、骨密度(bone mineral density, BMD)及骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)进行测量，根据缺损部位新生骨的形成情况来评估各组复合支架材料的成骨性能。

1.2.5 HE染色

Micro-CT扫描完成后，将颅骨模型置入4%多聚甲醛溶液固定24 h后，磷酸缓冲盐溶液清洗，EDTA脱钙3周；梯度乙醇脱水，包埋切片，烘干后依次放入二甲苯与无水乙醇中，苏木精溶液中染色5 min,流水冲洗；伊红染色液中染色30 s,流水冲洗；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，封片，镜下观察。

1.2.6 Masson染色

按照Masson染色试剂盒配制染液，滴加于颅骨切片进行染色5～10 min,显微镜下观察染色程度调整染色时间，流水冲洗，1%磷钨酸液处理切片4 min。亮绿染色液复染切片，5 min后再以1%冰醋酸水处理1 min;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，镜下观察。

1.3统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，两组间比较使用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 PAMAM磷酸化成功

将PAMAM与P-PAMAM树状大分子的FTIR光谱进行比较，发现P-PAMAM在1 000 cm-1波长附近有两个新的吸收峰(925 cm-1、1 020 cm-1)(图1),表明PAMAM被成功磷酸化。

图1 P-PAMAM的FTIR特征峰

2.2复合支架扫描电镜结果

将3组支架的横截面进行扫描电镜分析以研究复合支架的形态特征，可以观察到复合支架均具有良好孔隙且相互连接。对比3组支架，COL组孔径最大，PAMAM+COL组及P-PAMAM+COL组孔相对较小(图2)。

2.3 Micro-CT分析结果

Micro-CT扫描结果显示，与COL组比较，PAMAM+COL组和P-PAMAM+COL组在颅骨缺损边缘处可见新生的骨组织，P-PAMAM+COL组新生组织更为明显(图3A),提示P-PAMAM+COL成骨效果更显著。对SD大鼠颅骨骨质、骨量进行统计学分析，结果显示，与COL组和PAMAM+COL组相比，P-PAMAM+COL组BV、BV/TV、BMD及Tb.N数值均升高(P<0.05,图3B),说明P-PAMAM+COL组支架材料的促进成骨效能有所提升。

图2复合支架扫描电镜图像

图3颅骨缺损模型Micro-CT评估结果

2.4 HE及Masson染色结果

HE染色结果显示，3组支架植入后均无明显炎细胞浸润，P-PAMAM+COL组可见散在的深红色条带状结构，即新生骨小梁(图4A)。另外，Masson染色结果显示，与COL组和PAMAM+COL组相比，P-PAMAM+COL组支架的蓝染组织更多，染色更深(图4B),说明P-PAMAM+COL组新生骨形成更多，与Micro-CT分析结果基本一致，提示P-PAMAM+COL组支架具有一定的成骨修复作用。

图4颅骨缺损模型的组织学评价

3、讨论

牙本质是一种矿化组织，包括大约70%的无机矿物质、20%的有机基质和10%的水。其中有机成分包括18%的COL(占有机物的85%～90%)和2%的牙本质非胶原蛋白、蛋白多糖、生长因子、磷脂和酶等[14]。组织工程牙本质构建旨在通过移植材料(通常是支架、干细胞和生长因子),形成牙本质-牙髓复合体样组织。

牙本质磷蛋白是一种特异性存在于牙本质中的非胶原蛋白，其在牙本质形成和矿化及体内外牙髓组织再生方面有很大潜力[15],但此类天然的生长因子提取困难，因此寻找牙本质非胶原蛋白的仿生类似物尤为重要。PAMAM树枝状大分子不但具有低细胞毒性水平，且完全可控、易于修饰[7]。因此在本研究中，我们首先通过曼尼希反应将PAMAM分子末端阳离子氨基被取代为带负电荷的磷酸基团，从而将PAMAM分子转化为P-PAMAM分子，以模拟牙本质非胶原蛋白中磷酸化蛋白的功能[16]。P-PAMAM分子作为牙本质非胶原蛋白的仿生类似物，具有复制牙本质非胶原蛋白功能的能力，FTIR结果证实PAMAM被成功磷酸化。

支架的孔隙率和孔径大小是骨形成过程中非常重要的参数，良好的孔隙率不但可以促进支架内细胞的黏附与增殖，且利于营养物质的交换[17]。扫描电镜显示，3组支架均具有良好孔隙，而COL与PAMAM及P-PAMAM交联之后孔径有所减小，可能是由于引入体积庞大的树状大分子而导致的基质中的空间位阻[18]。P-PAMAM+COL组成骨能力更好可能与孔径减小有一定关系。有研究表明，较小的孔径对于成骨细胞的初始黏附更好，且孔径较小的支架材料具有较高的细胞增殖能力[19]。

Micro-CT三维重建分析、HE及Masson染色结果均显示，P-PAMAM+COL组可促进SD大鼠颅骨修复。一方面可能是由于COL1是骨组织细胞外基质的主要成分。有研究表明COL支架可应用于修复骨缺损，是因其可以通过诱导干细胞成骨向分化，促进磷酸酶活性、骨涎蛋白及骨桥蛋白的表达，从而影响骨的获取与维持[20]。另一方面也可能是由于P-PAMAM+COL组支架中磷酸盐的释放。有研究证实磷酸盐在成骨细胞分化中的作用，其可以通过调节成骨细胞的分化和生长，进而增加骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)的表达，进而影响骨形成和骨吸收[13]。细胞活跃的磷酸盐转运能力是骨矿化过程的必要条件[21]。

综上所述，P-PAMAM树状大分子复合COL支架具有更好的体内成骨诱导作用，因此该支架有望应用于口腔组织工程中的牙本质-牙髓再生以及活髓保存治疗中，但其促进成骨/牙分化的潜在机制有待进一步研究。

基金资助:国家自然科学基金(82270955);江苏省科教能力提升工程——江苏省研究型医院(YJXYYJSDW4);江苏省医学创新中心(CXZX202227);南京医科大学科技发展基金(NMUB20210158);

文章来源:关卓,刘洁,江飞,等.磷酸化聚酰胺-胺交联胶原蛋白支架体内成骨能力初探[J].口腔生物医学,2024,15(03):156-160.