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增生白玉芦汤对大鼠放射性口腔黏膜炎的治疗作用

2024-06-19 108 上传者：管理员

摘要：目的探讨增生白玉芦汤对大鼠放射性口腔黏膜炎的防治作用及其机制。方法取SPF级♂SD大鼠50只，除空白组10只外，所有大鼠头颈部接受25Gy X线放射照射1次，次日ig给药治疗10 d,每日1次，记录各组大鼠的一般情况、体重和颊黏膜变化；治疗结束后，收集心脏血并处死大鼠，收集颊黏膜组织用于相关炎性因子、蛋白、基因和病理检测。结果增生白玉芦汤组大鼠的一般情况较好，体质量下降程度小，口腔黏膜炎的程度较轻；白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平及颊黏膜组织中IL-1β、TNF-α、磷酸化核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α、磷酸化NF-κB的表达降低，但黏膜组织中表皮生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的含量升高。结论增生白玉芦汤能有效改善减轻大鼠口腔黏膜的炎性症状，减轻及修复颊黏膜损伤，其机制可能与抑制NF-κB信号通路及促进生长因子有关。

关键词：
作用与机制
增生白玉芦汤
放射性口腔黏膜炎
核因子κB信号通路
炎性浸润
辐射损伤
颊黏膜
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接受放射治疗的颈部恶性肿瘤患者几乎都会发生放射性口腔黏膜炎(RIOM),尽管有许多局部和系统的治疗方法，如L-谷氨酰胺呱仑酸钠能够抗炎、抗溃疡和增强黏膜防御等，但仍无有效、全面且不良反应小的方法[1]。甘肃省名中医裴正学教授认为：RIOM的主要病因为放射线，属中医的“火热毒邪”范畴[2],其自拟“增生白玉芦汤”可用于防治头颈部恶性肿瘤患者放疗引起的RIOM。前期临床研究发现：头颈部放疗患者联合增生白玉芦汤治疗后，RIOM的发生率降低，口腔黏膜炎症状减轻，患者的生活质量有所提高，且无明显的肝脏、肾脏、骨髓、心脏等方面的不良反应。但对其作用机制的研究仍不够深入。现建立急性RIOM大鼠模型，研究增生白玉芦汤对RIOM的治疗效果，并探讨其可能的作用机制。

1、实验部分

1.1仪器、试药与动物

电泳转印系统(美国Bio-Rad);HBS-1096A酶标仪(南京德铁实验设备有限公司);K5800微量核酸测定仪(北京凯奥科技发展有限公司);A300 PCR扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司);Archimed X6荧光定量PCR仪(鲲鹏基因北京科学仪器有限公司);WD-9423C化学发光成像系统(北京六一生物科技有限公司)。增生白玉芦汤(ZBD,甘肃省肿瘤医院中药房，由麦冬60 g、生地黄15 g、玄参15 g、西洋参30 g、五味子10 g、白芍10 g、玉竹10 g、芦根20 g、蜂蜜50 g等饮片组成);L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒(日本寿制药株式会社);大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫分析试剂盒(江苏酶免实业有限公司);尹红、苏木素、牛血清白蛋白(BSA)、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司);超敏鼠兔免疫组化检测试剂盒(美国Immunowa);反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司);Trizol Reagent(美国Thermo Fisher Scientific);PVDF膜(美国Millipore);磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IKBα)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、TNF-α一抗(美国Proteintech)。成年SPF级♂SD大鼠(兰州肽谷研究院，许可证号：SCXK甘2020-0001)50只，体重200～220 g。

1.2方法与结果

1.2.1大鼠的分组、造模与给药[3]

动物实验经兰州肽谷研究院实验动物伦理委员会批准，批准号：TGYJY-2023-0012。大鼠在SPF级环境下适应性喂养7 d,自由饮水、摄食。将50只大鼠随机均分为空白组、模型组、阳性组及增生白玉芦汤低、高剂量组。参照文献方法，ip 10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉大鼠，取仰卧位，固定四肢，平放于X射线辐照仪上，照射范围为大鼠双耳前连线前方的头部，用开口器牵开大鼠口腔并用5 mm厚的自制铅板防护装置保护颊部以外的头部区域，辐射剂量为25 Gy(5 Gy·min-1单次照射5 min),建立放射性口腔黏膜炎(RIOM)模型，空白组只麻醉不辐射。大鼠在辐射过程中身体均未扭动，在实验过程中均存活。照射后，大鼠四肢活动正常，在提起尾部时均未出现抽搐、瘫痪等体征。根据动物与人的体重剂量折算系数表确定给药剂量，于照射后第1天开始给药，每日1次，连续10 d。阳性组ig L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗0.3 g·kg-1,增生白玉芦汤低、高剂量组分别ig 3、12 g·kg-1增生白玉芦汤，空白组和模型组分别ig等体积的生理盐水。每日评估大鼠的体重、观察大鼠的一般情况及口腔黏膜的变化。第11天禁食水12 h, ip 10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉大鼠，心脏取血，收集血液于促凝管中。处死大鼠后，取双侧颊黏膜组织，一部分置4%多聚甲醛固定液中，一部分置冻存管中，于-80℃冰箱中保存。

1.2.2对RIOM大鼠一般状态与体重的影响

空白组大鼠在实验过程中摄食、饮水、精神状态及毛色均无明显异常，颊黏膜呈淡红色，湿润且有光泽；模型组大鼠摄食及饮水明显减少，精神萎靡，有明显脱毛及弓背现象；与模型组比较，增生白玉芦汤高、低剂量组及阳性组大鼠的一般情况较好。由图1可知：与空白组比较，各组大鼠的体重明显下降，而增生白玉芦汤高剂量组和阳性组大鼠的体重有所上升。

1.2.3对RIOM大鼠颊黏膜组织的影响

大鼠颊黏膜组织于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后，用酒精、二甲苯脱水透明后，石蜡包埋，切片，行HE染色，用奥林巴斯显微成像系统拍照，观察颊黏膜组织的病理形态变化。由图2可知：大鼠颊黏膜组织被覆复层鳞状上皮，空白组大鼠的颊黏膜上皮及固有层未见炎症细胞浸润；模型组的颊黏膜大部分上皮脱失，表面覆以坏死及炎性渗出，固有层见大量炎症细胞浸润，部分区域炎细胞浸润至浅肌层，小血管扩张、充血；阳性组的颊黏膜上皮完整，固有层见少量炎症细胞浸润；增生白玉芦汤低剂量组的颊黏膜未见上皮脱失，仅在上皮内及固有层浅层见较多量炎症细胞浸润；增生白玉芦汤高剂量组的颊黏膜固有层见散在炎症细胞浸润。表明增生白玉芦汤可改善RIOM大鼠颊黏膜组织的病理损伤。

图1各组大鼠体重的变化

图2空白组(A)、模型组(B)、阳性组(C)和增生白玉芦汤低(D)、高(E)剂量组大鼠口腔黏膜组织形态的HE染色图(200×)

1.2.4对RIOM大鼠颊黏膜组织中细胞生长因子含量的影响

大鼠颊黏膜组织于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后，用酒精、二甲苯脱水透明后，石蜡包埋，切片，按超敏鼠兔免疫组化检测试剂盒说明书操作行免疫组化染色，显微镜下拍照并观察各组大鼠颊黏膜组织的结构变化。与模型组比较，增生白玉芦汤高、低剂量组及阳性组的大鼠颊黏膜中表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量显著升高(均P<0.05),且增生白玉芦汤的浓度越高，EGF、VEGF及bFGF的含量越高(图3、表1)。

1.2.5对RIOM大鼠血清中炎症因子水平的影响

大鼠麻醉后取约2 mL心脏血，室温下自然凝固10～20 min,于2～8℃、2×103～3×103 r·min-1离心约20 min,收集上清液。采用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的水平。由表1可知：与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显著升高(均P<0.05),IL-10的含量显著下降(P<0.05);与模型组比较，增生白玉芦汤高、低剂量组及阳性组中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显著降低(均P<0.05),且增生白玉芦汤的浓度越高，IL-1β、IL-6、TNF-α的含量越低，但IL-10的含量无显著性变化(P>0.05)。

图3空白组(A)、模型组(B)、阳性组(C)和增生白玉芦汤高(D)、低(E)剂量组大鼠颊黏膜组织中EGF、VEGF、bFGF的表达(100×)

表1增生白玉芦汤对EGF、VEGF、bFGF及血清炎症因子水平的影响

1.2.6对RIOM大鼠颊黏膜组织中IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响

用Trizol试剂提取颊黏膜组织中的总RNA,按反转录试剂盒说明书操作，将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板，照荧光定量试剂盒说明书操作进行定量反应。以β-actin为内参，2-△△CT法计算IL-1β、TNF-αmRNA的相对表达量。TNF-α的上游引物：5’-GTCAGCCGATTTGCCATTT-3’,下游引物：5’-GGCTGGGTAGAGAACGGATG-3’;IL-1β的上游引物：5’-GCTTCCTTGTGCAAGTGT-3’,下游引物：5’-TGTCGAGATGCTGCTGTGAG-3’;β-actin的上游引物：5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCT,下游引物：5’-GTCAGGATGCCTCTCTTGCT-3’。由表2可知：与空白组比较，模型组大鼠颊黏膜中IL-1β、TNF-αmRNA的表达水平显著升高(均P<0.05);与模型组比较，增生白玉芦汤高、低剂量组及阳性组大鼠颊黏膜中IL-1β、TNF-αmRNA的表达水平显著降低(均P<0.05),且增生白玉芦汤的浓度越高，降低趋势越明显。

1.2.7对RIOM大鼠颊黏膜组织中NF-κB通路相关蛋白表达的影响

用RIPA裂解液裂解颊黏膜组织，在4℃、1.2×104 r·min-1离心15 min,收集蛋白质裂解物，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白的含量(表2)。蛋白样本变性，80 V恒压电泳30 min,电压调至120 V,直至目标蛋白分开，停止电泳。裁取PVDF膜于甲醇中浸泡激活，将膜和胶夹于转膜装置中，于冰上恒流(0.2 A)转膜2 h。置5%脱脂牛奶摇床上于室温下封闭2 h。分别以1:2000稀释加入p-IKBα、p-NF-κB、TNF-α一抗，于4℃孵育过夜；TBST洗膜(6 min×5),再用封闭液1:6000稀释二抗(稀释),于温室下孵育1 h; TBST洗膜(6 min×5),置化学发光仪中曝光，用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，电泳图见图4。与空白组比较，模型组大鼠颊黏膜中p-IKBα、p-NF-κB、TNF-α蛋白的表达显著升高(均P<0.05);与模型组比较，增生白玉芦汤高、低剂量组及阳性组大鼠颊黏膜中p-IKBα、p-NF-κB、TNF-α蛋白的表达显著降低(均P<0.05),且增生白玉芦汤的浓度越高，降低趋势越明显。

表2增生白玉芦汤对IL-1β、TNF-αmRNA和p-IKBα、p-NF-κB、TNF-a蛋白水平的影响

图4大鼠颊黏膜组织NF-κB通路相关蛋白的表达水平

1.2.8统计学分析

采用SPSS 24.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以

表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、讨论

放射性口腔黏膜炎(RIOM)以口腔溃疡为主要特征，可引起患者口腔的剧烈疼痛，使患者生活质量下降[4]。ROIM主要是因辐射导致口腔黏膜细胞凋亡，阻止上皮细胞增殖，活性氧自由基和各种炎症细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生，以及核因子κB(NF-κB)和许多激酶的激活，细胞将进入一个不可逆的炎症阶段[5,6,7,8,9]。文中显示：增生白玉芦汤能降低IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的水平及颊黏膜组织中IL-1β、TNF-α、p-IKBα、p-NF-κB的表达，从而有效治疗大鼠放射性口腔黏膜炎。上表皮生长因子(EGF)广泛分布于人的体液中，可调节上皮细胞的增殖、生长和迁移，维持上皮屏障，参与修复受损黏膜[10]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对创面愈合具有积极作用。血管内皮生长因子(VEGF)可加快伤口愈合，升高VEGF的水平可降低炎症反应，促进溃疡愈合。增生白玉芦汤能提高黏膜组织中EGF、VEGF、bFGF的含量，从而减轻及修复颊黏膜损伤。综上，增生白玉芦汤能明显推迟口腔黏膜炎的发生时间，减少大鼠口腔溃疡糜烂、改善精神状态、维持口腔黏膜的完整性及改善口腔黏膜的炎性浸润等病理状态，抑制促炎因子的分泌和NF-κB蛋白的表达；其可能是通过抑制NF-κB信号通路，下调促炎因子，上调生长因子，从而促进口腔黏膜溃疡的愈合。

参考文献:

[2]张桂琼,张强,韩鹏炳,等.裴正学教授对放射性口腔黏膜炎的辨治经验[J].中医临床研究,2022,14(12):72-74.

[3]刘向荣,聂含竹,黄皓麟,等.口疡防愈凝胶对大鼠放射性口腔炎的保护作用及机制研究[J].湖南中医药大学学报,2021,41(2):218-223.

[7]李明珠,金圣博.养阴清肺汤联合美洲大蠊研末治疗30例鼻咽癌患者放疗后急性放射性口腔黏膜炎的临床疗效[J].华西药学杂志,2018,33(5):570-572.

基金资助:甘肃省中医药科研课题(GZKP-2022-28);

文章来源:崔阳阳,张桂琼,张强,等.增生白玉芦汤对大鼠放射性口腔黏膜炎的治疗作用[J].华西药学杂志,2024,39(03):289-293.