颅颌面骨组织的缺损、缺失不仅严重影响口腔咀嚼、语言、吞咽等生理功能，更影响患者颜面美观。脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)是取自于人体脂肪组织的一类成体干细胞，因其体内分布广，取材容易，细胞获得量大，近年来受到越来越多的关注。这种干细胞具有多向分化潜能，可以定向分化为多种组织细胞，如内皮细胞、神经前体细胞、软骨细胞、肌细胞以及骨细胞等[1-5]。目前研究表明，与其他干细胞相比，ADSCs具有良好的干细胞特性[6]。这些细胞特性表明，ADSCs作为种子细胞介导骨组织再生，具有良好的应用前景。微小RNA(microRNA,miRNA)作为一类非编码单链RNA分子，参与调控细胞分化、存活、凋亡等重要的生物学过程。特定miRNA通过与目标基因mRNA的3′非编码区结合，抑制其翻译或促进其降解，从而精细调控干细胞向成骨细胞的分化[7]。例如，miRNA能够正向调控成骨相关基因的表达，如Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)和成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)。相反，其他miRNA可能通过靶向这些关键成骨分化因子，从而起到抑制成骨分化的作用[8]。通过精确调控miRNA的表达，有望优化干细胞的治疗潜能，为骨缺损的修复和骨组织再生开辟新的道路。

细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是细胞之间的主要成分，对于维持组织结构和功能至关重要。纤维蛋白(fibulin, FBLN)家族在ECM的结构稳定性和功能调节中起着重要作用[9]。FBLN1通过促进细胞间相互作用以及调节细胞-基质的相互作用，对骨骼形成和再生具有重要的影响。此外，FBLN1还在多种疾病的发生发展中扮演着重要角色，包括肿瘤的侵袭和转移、心血管疾病以及组织纤维化[10]。因此，FBLN1不仅是维持组织结构和功能的关键因子，也是潜在的疾病治疗靶点。本研究通过探索miR-615-3p与FBLN1在调节ADSCs成骨分化中的作用，拓展对ADSCs成骨分化机制，也为开发新的治疗策略提供靶点。

1、材料与方法

1.1主要试剂

人ADSCs(ScienCell,美国),α-MEM培养基、0.25%胰蛋白酶(上海赛默飞),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素-链霉素、StemPro®成骨诱导液(Invitrogen,美国),聚凝胺、嘌呤霉素(合肥兰杰柯),miR-615-3p敲低慢病毒、FBLN1过表达慢病毒、对照组慢病毒(苏州吉玛),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性试剂盒、茜素红染液(Sigma-Aldrich,美国),提RNA试剂盒(北京康为世纪),Trizol、反转录试剂盒、TaqMan microRNA逆转录试剂盒、TaqManTMmicroRNA检测试剂盒(Invitrogen,美国),MagicSYBR Mixture(北京康为世纪),PCR引物(上海生工),U6引物(上海赛默飞),牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)抗体、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein 1,DMP1)抗体、FBLN1抗体(Abcam,美国),β-actin抗体、GAPDH抗体(北京普利来)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

ADSCs细胞培养在含10% FBS、1%青霉素-链霉素的α-MEM培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养。每2～3 d换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况，待细胞融合达80%～85%时，0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3的比例传代，取第3～5代细胞用于后续实验。

1.2.2细胞转染与分组

ADSCs铺板，将miR-615-3p敲低慢病毒(miR-615-3p敲低组)、对照组慢病毒(对照组)、FBLN1过表达慢病毒(FBLN1过表达组)在6μg/mL聚凝胺作用下转染ADSCs 12 h,换液48 h后，用1μg/mL的嘌呤霉素筛选7 d,用于后续实验。miR-615-3p敲低慢病毒序列为：5′-AAGAGGGAGACCCAGGCTCGGA-3′;FBLN1过表达慢病毒序列为：5′-GCTGCCGACCCAAGCTACAGT-3′;对照组慢病毒序列为：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′。

1.2.3 ALP活性检测

将对照组、miR-615-3p敲低组、FBLN1过表达组细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，待细胞融合至80%后，用StemPro®成骨诱导液将ADSCs向成骨方向分化诱导，每3 d换液1次。ADSCs成骨诱导5 d后，ALP活性试剂盒对其进行ALP活性测定。

1.2.4茜素红染色

成骨诱导步骤同1.2.3,对照组、miR-615-3p敲低组、FBLN1过表达组ADSCs成骨诱导培养14 d后，用70%乙醇固定，用2%茜素红染色10 min,弃染色液后用蒸馏水冲洗3次，于显微镜下观察矿化结节。

1.2.5实时荧光定量PCR

收集对照组和miR-615-3p敲低组RNA,使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒进行逆转录。使用miRNA特异性TaqManTMmicroRNA检测试剂盒测定miR-615-3p的稳态水平，U6用作上样对照。使用2-ΔΔCt方法计算miR-615-3p和U6相对表达量。miR-615-3p序列：UCCGAGCCUGGGUCUCCCUCUU;U6序列：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCC-CTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTT-CCATATTTT。

利用Trizol提取对照组、miR-615-3p敲低组和FBLN1过表达组细胞的总RNA,测定浓度后，按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。按照PCR试剂盒说明书，将MagicSYBR Mixture配制反应体系并进行实时荧光定量PCR,反应程序为：95℃120 s; 95℃20 s, 60℃25 s, 72℃20 s, 40个循环。以GAPDH作为内参，按照2-ΔΔCt法计算FBLN1基因的相对表达。分别收集成骨诱导3 d的对照组、miR-615-3p敲低组和FBLN1过表达组的总RNA,操作方法同上，以GAPDH作为内参，计算OSX基因的相对表达量。分别收集成骨诱导0、7、14 d的对照组、miR-615-3p敲低组和FBLN1过表达组细胞的总RNA,操作方法同上，以GAPDH作为内参，检测DMP1和DSPP基因相对表达。引物序列见表1。

表1引物序列

1.2.6 Western blot

检测对照组和miR-615-3p敲低组FBLN1蛋白表达情况：收集两组细胞，使用RIPA裂解液提取ADSCs细胞总蛋白，考马斯亮蓝测定总蛋白浓度。每组取20μg细胞总蛋白进行凝胶电泳，半干转转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h,孵育FBLN1一抗(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000),4℃摇床过夜，次日室温孵育二抗(1∶5 000)1 h, TBST洗膜，ECL发光，凝胶成像系统采集图像。检测对照组和FBLN1过表达组FBLN1过表达效率：收集两组细胞蛋白，电泳、转模、孵育FBLN1单克隆抗体(1∶2 000)、β-actin(1∶5 000)一抗，室温孵育二抗(1∶5 000)1 h,其余操作同上。

收集ADSCs成骨诱导7 d的对照组、miR-615-3p敲低组和FBLN1过表达组细胞，使用RIPA裂解液提取ADSCs细胞总蛋白，电泳、转模、孵育DSPP、DMP1(均为1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)一抗，4℃摇床过夜，次日室温孵育二抗(1∶5 000)1 h,其余操作同上。

1.3统计学分析

采用SPSS 26统计学软件进行数据分析，所有数据均以均数±标准差表示。两组间的差异比较采用独立样本t检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。

2、结 果

2.1 miR-615-3p抑制ADSCs的成骨分化能力

利用慢病毒转染技术敲除miR-615-3p,实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，miR-615-3p敲低组miR-615-3p基因表达水平降低(P<0.001,图1A),证实已成功构建miR-615-3p稳定低表达的ADSCs。ADSCs经成骨诱导5 d, ALP活性检测结果显示，相比于对照组，miR-615-3p敲低组ALP活性表达更高(P<0.001,图1B)。ADSCs经成骨诱导14 d,茜素红染色结果表明，miR-615-3p敲低组有数量更多、着色更深的钙化结节(图1C),提示敲低miR-615-3p促进ADSCs的成骨分化能力。

图1敲低miR-615-3p对ADSCs成骨分化的影响

2.2 miR-615-3p抑制ADSCs骨向分化相关基因及蛋白的表达

利用慢病毒转染技术敲低miR-615-3p, ADSCs经成骨矿化诱导3 d,实时荧光定量PCR结果显示，敲低miR-615-3p后，OSX基因表达升高(P<0.05,图2A)。ADSCs经成骨诱导7、14 d,实时荧光定量PCR结果显示，敲低miR-615-3p后，DSPP和DMP1基因表达上升(P<0.05,图2B、C)。ADSCs经成骨诱导7 d, Western blot结果显示，miR-615-3p敲低组DMP1和DSPP蛋白条带加深(图2D)。

2.3敲低miR-615-3p后ADSCs中FBLN1表达增高

敲低miR-615-3p后，通过实时荧光定量PCR和Western blot检测对照组和miR-615-3p敲低组ADSCs中FBLN1的表达，结果显示，敲低miR-615-3p后FBLN1蛋白及基因(P<0.01)表达均增高(图3A、B),表明miR-615-3p下调促进FBLN1的表达。

图2敲低miR-615-3p对ADSCs成骨分化相关基因及蛋白表达的影响

图3 FBLN1在miR-615-3p敲低的ADSCs中的表达

2.4 FBLN1增强ADSCs的成骨分化能力

利用慢病毒转染技术过表达FBLN1,Western blot和实时荧光定量PCR结果均显示，ADSCs中FBLN1过表达组FBLN1蛋白及基因(P<0.01)表达增高(图4A、B),证实已成功构建FBLN1稳定过表达的ADSCs。ADSCs经成骨诱导5 d, ALP活性结果表明，相比于对照组，FBLN1过表达组ALP活性更高(P<0.05,图4C)。ADSCs经成骨诱导14 d后，茜素红染色结果表明，FBLN1过表达组有数量更多、着色更深的钙化结节(图4D),提示过表达FBLN1促进ADSCs的成骨分化能力。

图4过表达FBLN1对ADSCs成骨分化的影响

2.5 FBLN1促进ADSCs骨向分化相关基因及蛋白表达

利用慢病毒转染技术过表达FBLN1,ADSCs经成骨矿化诱导3 d,实时荧光定量PCR结果显示，过表达FBLN1后OSX基因表达升高(P<0.01,图5A)。ADSCs经成骨诱导7、14 d,实时荧光定量PCR结果显示，过表达FBLN1后，DSPP和DMP1基因表达升高(P<0.05,图5B、C)。ADSCs经成骨诱导7 d, Western blot结果显示，FBLN1过表达组DMP1和DSPP蛋白条带变深(图5D)。

3、讨 论

ADSCs在骨组织工程中的临床前应用取得了一些结果[11-14]。然而，由于其具体的分子机制尚不清楚，其功能受到长期扩增培养和冷冻保存的影响，限制ADSCs的临床应用。

研究表明，miRNA是干细胞成骨/成牙分化的关键调控因子[15]。有研究显示，miR-615-3p可通过抑制间充质干细胞向肺泡型Ⅱ上皮细胞分化，加速新生儿急性呼吸窘迫综合征的进展[16]。先前有研究表明，miR-615-3p基因抑制骨髓间充质干细胞的成软骨分化，从而促进骨关节炎的进展[17]。据报道，在糖皮质激素诱导的骨质流失过程中，miR-615-3p表达异常[18]。近期有研究表明，miR-615-3p通过负调控生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF5)和叉头框O蛋白1(forkhead box class O proteins 1,FOXO1)抑制人黄韧带细胞成骨分化[19]。此外，具有调节成骨能力的miR-615-3p在人ADSCs的微囊泡中高表达[20]。这些结果均提示，miR-615-3p可能在间充质干细胞分化调控中具有功能作用。在本研究中，敲低miR-615-3p的ADSCs进行矿化诱导后，ALP活性上升，茜素红染色更深，成骨相关基因(OSX、DMP1、DSPP)表达升高，证实miR-615-3p的表达在ADSCs的成骨分化过程中起着抑制的作用。

图5过表达FBLN1对ADSCs的成骨分化相关基因及蛋白表达的影响

FBLN1沉积在ECM中并与成骨细胞成熟密切相关。然而，FBLN1对骨再生的影响和潜在的调控机制仍有待阐明。据报道，缺乏FBLN1的突变小鼠胚胎骨骼发育异常和骨量减少[21]。先前有研究表明，FBLN1可以促进颅骨中膜骨和软骨内骨的形成，并通过改善成骨过程中BMP2的成骨信号活性，影响成骨必需的转录因子OSX、Runx2的表达[22-23]。本实验结果表明，敲低miR-615-3p的ADSCs中，FBLN1表达升高，且过表达FBLN1后ALP活性上升，茜素红染色更深，成骨相关指标(OSX、DMP1、DSPP)表达升高，证实FBLN1的表达在ADSCs的成骨分化过程中起着促进的作用，且miR-615-3p可能通过靶向FBLN1进而调控ADSCs的成骨分化。

OSX对成骨细胞增殖、分化和骨形成至关重要。遗传研究表明，OSX是成骨细胞分化信号通路中Runx2的下游基因[24]。DSPP和DMP1是高度磷酸化的蛋白质，对于牙齿和骨骼等硬组织的正常发育至关重要。DMP1的特异性结合以及其他非胶原蛋白在胶原纤维上的沉积，是胶原基质的形成和矿化的关键步骤。先前有研究表明，DSPP和DMP1敲除的小鼠在出生后出现明显的牙齿表型变化，包括从前牙本质到牙本质的部分成熟失败、牙髓腔室增大，伴有前牙本质宽度增加和牙本质低矿化[25]。本实验利用实时荧光定量PCR和Western blot检测成骨诱导后OSX、DMP1、DSPP的表达，结果发现其表达与miR-615-3p成负相关，与FBLN1成正相关，提示miR-615-3p通过靶向FBLN1进而调控关键成骨因子，然而其具体机制有待进一步研究。

综上，本研究结果表明miR-615-3p是ADSCs成骨分化的抑制基因，miR-615-3p通过靶向FBLN1进而调控ADSCs的成骨分化，有助于进一步揭示miR-615-3p的功能调控机制，为促进ADSCs的定向分化与骨组织再生功能提供理论依据和潜在靶点。

基金资助:国家自然科学基金项目(82201010);首都医科大学北京口腔医院创新研究团队项目(CXTD202204);

文章来源:黄艺舒,范志朋,杨昊清.miR-615-3p通过负调控FBLN1的表达抑制脂肪干细胞成骨分化[J].口腔生物医学,2024,15(04):212-216+234.