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RD、KMB-17及Vero细胞对肠道病毒分离培养敏感性的比较

2024-08-21 183 上传者：管理员

摘要：目的比较人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对肠道病毒（enterovirus,EV）分离培养的敏感性，以期为后续EV各基因型毒株的分离提供实验依据。方法收集2019年昆明市某医院确诊手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）患者粪便样本60份，分别采用RD、KMB-17和Vero细胞分离培养EV，并对阳性样本进行RT-PCR检测、测序及NCBI BLAST比对，鉴定EV基因型。结果共分离获得112株EV，分别属于11种基因型。其中RD细胞分离出26株Echo-11,6株Echo-6和Echo-30,2株CV-A4和CV-A10,1株CV-A6、CV-A16和Echo-18;KMB-17细胞分离出42株Echo-11,3株Echo-6和2株Echo-30;Vero细胞分离出6株CV-B1,5株CV-B3,4株Echo-11,3株CV-A16和1株CV-B2。结论 RD细胞对大部分EV均敏感，KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感。

关键词：
KMB-17细胞
RD细胞
Vero细胞
细胞敏感性
肠道病毒
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肠道病毒enterovirus,EV）属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属，100多种EV与人类疾病相关[1-3]。EV一般通过粪-口途径传播，其感染大多数是自限性的，但也有一些显性症状，如手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）、1型糖尿病、无菌性脑膜炎、急性迟缓性麻痹等[4-7]。与人类疾病相关的EV可分为4种血清型（A～D),A～D血清型可进一步分为25、63、23、5种基因型。目前，可采用一些分子生物学手段快速检测EV，但细胞分离培养法一直是临床病毒学实验室鉴定的“金标准”。

不同病毒对不同细胞系的敏感性不同，单一细胞系不能分离所有EV，因此，探讨各种细胞对病毒的敏感性有利于优化其分离培养效果[8-11]。本研究分别采用人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对60份HFMD患者粪便样本进行EV分离培养，并通过RT-PCR及测序法检测3种细胞分离EV的基因型，以期为今后EV各基因型毒株的分离提供实验依据。

1、材料与方法

1.1样本

收集2019年昆明市某医院根据《手足口病诊疗指南（2018）》诊断为HFMD急性感染期患者的粪便样本60份。本研究获得中国医学科学院医学生物学研究所伦理委员会批准（医科生伦字[2016]43号）。

1.2细胞

RD、KMB-17和Vero细胞均由中国医学科学院医学生物学研究所保存并提供。

1.3主要试剂及仪器

DMEM、MEM和PBS均购自美国Gibco公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒Axygen Body Fluid DNA/RNA Miniprep Kit购自美国Axygen公司；Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit购自日本Ta Ka Ra公司；0.45和0.22μm过滤器购自美国Millipore公司。

1.4细胞培养

将RD、KMB-17和Vero细胞接种至24孔板，1×106个/孔，用DMEM培养基于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养至单层，用于后续试验。

1.5病毒分离培养

将收集的样本按每克3 m L的比例加入PBS，制备成粪便悬液，3 000×g离心30 min，取上清液，依次用0.45和0.22μm过滤器过滤。将生长为单层的RD、KMB-17和Vero细胞分别用PBS洗涤3次，加入上述过滤液，200μL/孔，同时加入维持液（谷氨酰胺20 m L，双抗10 m L,6.6%Na HCO340 m L,MEM 930 m L),1 m L/孔，于35℃，5%CO2细胞培养箱培养3～7 d，每日置倒置显微镜下观察细胞生长状态。当出现细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）时，收集细胞，-20℃保存；培养7 d仍未出现CPE时，收获细胞，并反复冻融3次，盲传3代，出现CPE判定为阳性，仍未出现CPE时，判定为阴性，阳性样本于-20℃保存。均以正常培养的细胞为对照。

1.6 RT-PCR检测

根据文献[12]设计针对EV VP1的通用引物，AN89:5′-CCAGCACTGACAGCAGYNG-ARAYNGG-3′，AN88:5′-TACTGGACCACCTGGNGGN-AYRWACAT-3′（分别位于2 602～2 627 aa和2 977～2 951 aa），扩增产物大小为376 bp。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。收集发生CPE的细胞，采用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取总RNA，以其为模板，AN88和AN89为引物扩增VP1基因片段。PCR反应条件为：50℃30 s,94℃2 min;94℃30 s,50℃30 s,72℃70 s，共30个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.7测序及序列分析

将RT-PCR鉴定阳性的产物送昆明擎科生物科技有限公司进行测序，并应用NCBI BLAST工具对序列进行比对。

1.8数据采集及分析

应用BIO-RAD Gel Doc XR软件进行数据采集及分析，PS CC 2019软件作图。

2、结果

2.1病毒分离培养

采用3种细胞对60份HMFD患者粪便样本进行EV分离培养，共分离出112株EV，其中RD细胞分离出46株，分离率为76.70%(46/112);KMB-17细胞分离出47株，分离率为42.00%(47/112);Vero细胞分离出19株，分离率为17.00%(19/112）。见图1。

2.2 RT-PCR鉴定

112株发生CPE的细胞经RT-PCR鉴定，均可见376 bp的VP1基因条带，大小与预期一致，见图2。

2.3测序及序列分析

测序结果表明，分离获得的112株EV共分为11个基因型，其中72株为Echo-11，占比64.30%(72/112);9株为Echo-6，占比8.00%(9/112);8株为Echo-30，占比7.10%(8/112);CV-B1和CV-B3分别有6株，占比均为5.40%(6/112);4株为CV-A16，占比3.60%(4/112);2株为CV-A4，占比1.80%(2/112);CV-A6、CV-B2和Echo-18分别有1株，占比均为0.90%(1/112);2株为CV-A10，占比1.80%(2/112）。112株EV中，103株为CV-B血清型，占比92.00%(103/112),9株为EV-A血清型，占比8.00%(9/112）。另外，在所有EV感染的病例中，至少有21例为合并感染病例（至少有两种病原体），占比35.00%(21/60），其中最常见的共感染模式是Echo-11与其他EV共感染，占比30.00%(18/60），其次为CVB1与其他EV共感染，占比10.00%(6/60）。RD细胞分离获得2株CV-A4、1株CV-A6、1株CV-A16、2株CV-A10、6株Echo-6、26株Echo-11、1株Echo-18、6株Echo-30和1株CV-B3;KMB-17细胞分离获得3株Echo-6、42株Echo-11和2株Echo-30;Vero细胞分离获得3株CV-A16、4株Echo-11、6株CV-B1、1株CV-B2和5株CV-B3。

图1 3种细胞CPE情况的镜下观察（×100)

图2 VP1基因PCR产物电泳图

3、讨论

采用单一细胞系分离病毒存在一定局限性，本研究采用KMB-17、RD和Vero细胞对EV分离培养，比较3种细胞对EV的敏感性。RD细胞常用于脊髓灰质炎病毒和CV-A的分离培养[13-15]，本研究结果发现，RD细胞能分离获得9种不同基因型的EV，分离率为76.70%，能分离所有CV-A，对EV-B也有良好的敏感性，尤其是Echo，但RD细胞是肿瘤源性细胞，其分离的病毒不能作为疫苗毒种。Vero和人胚肺二培体细胞（如2BS和KMB-17细胞）则可用作疫苗细胞基质。作为人用疫苗，选择人源细胞作为生产用细胞基质，不仅能够提供良好的品质，且具有更好的安全性。KMB-17细胞是由中国医学科学院医学生物学研究所建立的一种二倍体细胞，多用于肺损伤或分化的研究，也是疫苗生产的主要细胞系之一，已用于生产EV71灭活疫苗、脊髓灰质炎减毒活疫苗和H2甲型肝炎减毒活疫苗等[16-19]。本研究采用KMB-17细胞能分离获得3种不同病毒，还发现其对EV-B的Echo最为敏感，尤其是Echo-11，但并未分离到CV-A毒株。有研究采用人胚肺细胞MRC-5、人非小细胞肺癌细胞A549、人喉癌细胞He P-2及RD细胞对EV分离培养，结果表明，MRC-5细胞对Echo最敏感[20]。另外，KMB-17和MRC-5细胞均属于人胚肺二倍体细胞系，因此，KMB-17细胞可代替MRC-5作为EV分离的细胞基质，基于KMB-17细胞分离获得EV可作为疫苗毒种。Vero细胞对多种病毒均敏感，能够产生较高的病毒滴度，生长速度快且遗传特征稳定，曾用于流感减毒活疫苗、狂犬病疫苗和脊髓灰质炎灭活疫苗等的生产[21]。本研究采用Vero细胞分离获得5种基因型EV，尤其对CV-B敏感，但对CV-A总体分离率低，仅对CV-A16较为敏感。有研究采用Vero、RD、He P-2和MRC-5细胞分离CV-A16时发现，Vero细胞对CV-A16最敏感[22]，与本研究结果一致。另有研究表明，He P-2细胞是分离CV-B最敏感的细胞系，分离率为82.6%[20]。

另外，引起HFMD的主要病原为EV-A血清型，如EV-71、CV-A16、CV-A6和CV-A10等[23]。2021年，山东省调查研究发现，引起HFMD的EV有31株（17.4%）为CV-B，其中21株（11.8%）为CV-B4[24];2012—2019年，韩国一项回顾性调查研究也发现，分离获得的EV大部分为EV-B血清型[25]；本研究结果表明，60份样本大部分为EV-B血清型，但由于样品数量较少，还有待进一步研究。同时，还存在不同基因型病毒株共同感染情况，当不同基因型病毒在同一个细胞感染并复制时，易发生病毒重组[26]。这种流行病学特征对HFMD的诊断提出了新的挑战，也可能影响疾病发展[27]。

综上所述，采用敏感性较高的细胞系能够显著提高EV分离率，其中RD细胞能够分离大多数基因型EV,KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感。

参考文献:

[4]陈娜,王成,马小珍. 2006—2020年四川省急性弛缓性麻痹病例中柯萨奇B组病毒的基因特征分析[J].现代预防医学,2022,49(3):518-521.

[8]高微捷,岳磊,杨婷,等.不同细胞对柯萨奇病毒A组10型毒株的敏感性及滴度检测影响因素分析[J].中国病毒病杂志,2020,10(4):267-271.

基金资助:云南省科技计划项目(202202AA100016,202002AA100009);云南省创新团队项目(202105AE160020);云南省基础研究专项(20230-1AT070367);

文章来源:刘煜菡,张名,许丹菡,等.RD､KMB-17及Vero细胞对肠道病毒分离培养敏感性的比较[J].中国生物制品学杂志,2024,37(08):917-920.