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外泌体在牙周炎发生发展及诊疗中作用研究进展

2024-02-01 248 上传者：管理员

摘要：外泌体由体内多种细胞分泌，是含有核酸、蛋白质及脂质的微小囊泡结构，广泛存在于体液中。现有研究表明外泌体在牙周炎发生发展、诊断及治疗方面具有重要作用。微生物源性和宿主源性外泌体可通过调节细胞炎症水平或机体免疫反应来影响牙周炎的发生发展。唾液外泌体易采集、含量丰富且理化性质稳定，含有多种微小RNAs(microRNAs,miRNAs)和蛋白质等分子，近年来成为诊断牙周炎的新型生物标志物。在牙周炎的治疗中，外泌体用于修复牙槽骨缺损及促进牙髓牙本质再生的研究逐渐增多；此外，外泌体还具有靶向药物载体的潜能。基于外泌体的重要功能及应用价值，文章就外泌体在牙周炎发生发展、临床诊断及治疗等方面作用的研究进展做一综述，为后续研究及临床应用提供思路。

关键词：
外泌体
牙周炎
牙周组织
牙菌斑
生物标志物
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牙周炎为全球第六大疾病，是由牙菌斑中微生物侵犯牙周组织引起的炎性疾病，可造成牙槽骨、牙龈等支持组织进行性受损，最终导致患牙脱落。牙周炎可根据牙周袋深度（periodontal pocket depth,PPD）、临床附着丧失（clinical attachment loss,CAL）程度分为轻度、中度及重度；约10%的成年人患有重度牙周炎。牙周炎的治疗方式与疾病严重程度密切相关，故准确判断患者病情十分重要[1]。

液体活检为体外诊断的分支，因非侵入性、操作简便而广泛应用于临床，为多种疾病的早筛早治提供依据。外泌体由人体内多种细胞分泌，是含有核酸、蛋白质及脂质的微小囊泡结构，广泛存在于体液中；其内容物的丰富程度与牙周炎病情严重程度相关[2,3]。此外，微生物源性及宿主源性外泌体可通过改变细胞炎症水平、影响破骨细胞分化过程等机制影响牙周炎的发生发展[4,5]；且外泌体具有体积小、免疫原性低及生物相容性高等特点，可作为纳米生物材料实现靶向给药[6]。基于外泌体的重要功能及应用价值，本文就外泌体在牙周炎的发生发展及诊疗中作用的研究进展做一综述，旨在为后续研究及临床应用提供思路。

1、外泌体概述

外泌体被厚约5 nm的双层脂质包裹，呈直径30～150 nm的球形[7]；其形成过程通常包括胞外物质内吞、内容物成熟及胞吐。外泌体最早被描述为网织红细胞成熟过程中生成的小囊泡，介导红细胞转铁蛋白受体的选择性外化和清除；后被认为是细胞成熟时调节膜释放的结构，可去除细胞碎片和多余的细胞表面分子[8]。外泌体分布广泛、结构特殊且内容物丰富，在疾病的发生发展和诊疗中起重要作用：微生物源性外泌体可携带和释放蛋白质及遗传物质，参与微生物与宿主的相互作用；巨噬细胞源性外泌体可介导癌细胞迁移[9]；特异性外泌体可参与机体免疫激活等[10]。此外，外泌体在组织再生、靶向治疗、仿生医学及作为生物标志物等方面具有潜在应用价值[11,12]。外泌体丰富的分子作用机制及多样的临床应用潜力使其不断成为生物医学领域的研究热点。

2、外泌体在牙周炎发生发展中的作用

牙菌斑是牙周炎的始动因子，牙周炎相关致病微生物不仅可通过菌体本身致病，还可通过外泌体来影响其发生发展。伴放线聚集杆菌的聚集是局限型侵袭性牙周炎发生的重要诱因，其产生的白细胞毒素特异性攻击宿主免疫系统，为细菌定植创造条件[4]；当白细胞毒素被分泌至外泌体并随体液播散时，牙周炎病情也随之进展[13]。牙龈卟啉单胞菌源性外泌体可显著上调巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）及白细胞介素（interleukin,IL)-6等炎症因子表达，造成牙周炎的慢性进展[13]。

此外，宿主源性外泌体在牙周炎的发展过程中也起着重要作用。牙周韧带成纤维细胞（peri⁃odontal ligament fibroblasts,PDLFs）是牙周炎早期接触病原微生物的主要细胞群，当PDLFs源性外泌体受到脂多糖刺激时，骨细胞中IL-6及TNF-α的表达量增加，胶原蛋白-1、骨保护素等成骨相关分子表达量及碱性磷酸酶活性下降，造成牙槽骨的吸收破坏[14]；而在循环拉伸应力作用下，PDLFs源性外泌体可通过抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB）途径来下调受到脂多糖刺激的巨噬细胞中IL-1β的表达，从而阻碍牙周炎进展[15]。牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）是特殊的间充质干细胞，与周围炎症微环境相互作用时具有自我更新能力[16]；受到脂多糖刺激的PDLSCs源性外泌体中含有更多的miR-155-5p及其下游分子Sirtuin-1，可下调辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17）数量并上调调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）数量，即通过T17/Treg/miR-155-5p/Sirtuin-1调控网络来抑制细胞炎症水平，进而延缓病情进展[17]。

由此可见，微生物源性和宿主源性外泌体可通过调节细胞炎症水平及机体免疫反应等来影响牙周炎的发生发展。探明不同源性外泌体在牙周炎发生发展中的作用机制可为临床提供潜在治疗靶点。

3、外泌体在牙周炎诊断中的作用

唾液外泌体主要由唾液腺细胞及部分口腔定植菌群分泌，含有丰富的DNAs、微小RNAs(mi⁃croRNAs,miRNAs）、蛋白质及多种细胞代谢物。唾液外泌体的采集具有非侵入性、操作便捷及费用低等优点，使其成为理想的疾病诊断及监测指标[18]。

3.1唾液外泌体相关miRNAs

唾液外泌体中的miRNAs有2种存在形式，即与蛋白质结合形成复合物或直接被微囊泡包裹；该存在形式可避免其被降解，保证其在唾液中理化性质稳定且数量充足[19]。目前已有多种miRNAs被认为在牙周炎的诊断中具有重要作用。

慢性牙周炎患者的唾液外泌体中miR-381-3p表达量增加，其与PPD相关而与CAL无关，表明其主要反映牙周状态而非特异性累及情况，可用于牙周炎的诊断[20]；此外，miR-155[21]、miR-3198[22]及miR-143-3p[23]被指出也可作为临床检测牙周炎的标志物。miR-125a-3p可诱导牙周组织Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4）表达，通过激活机体固有免疫来对抗牙周炎致病菌，因此miR-125a-3p表达量增加提示牙周炎处于进展期[3,24]。Fujimori等[25]指出进展期牙周炎患者唾液外泌体中miR-5571-5p表达量减少，let-7f-5p、miR-99a-5p、miR-28-5p及miR-320d表达量增加，其可通过调节丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路上调细胞炎症水平来诱导细胞凋亡[26]。Kato等[27]发现慢性牙周炎患者的龈沟液中miR-2043p含量可减少至正常值的1/8左右，而miR-2043p的表达与IL-1及IL-6等炎症因子的表达呈负相关[28]，因此可通过其含量来判断牙周炎症程度。另外，miR-4487可通过激活MAPK信号通路上调IL-6表达，在重度牙周炎患者中的含量显著增加[29]。miR-140-5p、miR-146a-5p及miR-628-5p仅可在重度牙周炎患者的唾液外泌体中检测到，而在健康人和轻度牙周炎患者中无法检出[30]。

总之，miR-125a-3p、let-7f-5p、miR-99a-5p、miR-28-5p、miR-320d等表达量增加或miR-5571-5p、miR-2043p等表达量减少提示牙周炎病情仍在进展；而miR-4487表达量显著增加或在唾液外泌体中检测到miR-140-5p、miR-146a-5p、miR-628-5p等提示牙周炎已进展至重度。

3.2唾液外泌体相关蛋白质

蛋白质是构成机体的基础大分子，广泛调控生命活动过程，也是外泌体的重要内容物之一。多种蛋白质配体、受体及酶在牙周炎发生发展中发挥重要作用，可作为生物学指标判断牙周炎病情。

程序性死亡配体-1(programmed cell death 1ligand 1,PD-L1）又称CD274，参与介导牙周炎等免疫炎症反应[31]。轻度、中度及重度牙周炎患者牙龈及龈沟液中均可见PD-L1表达量增加[32]。牙龈卟啉单胞菌在牙周炎进展中抑制部分T细胞分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ），上调CD11b+T细胞的程序性死亡受体-1(programmed cell death-1,PD-1）及其配体PD-L1的表达[32]。在慢性牙周炎患者中也发现PD-L1在外周CD4+T细胞和CD8+T细胞源性外泌体中含量增加，提示PD-L1高表达与牙周炎的慢性进展相关[33]。Yu等[34]基于已有研究提出可根据PD-L1的表达量来判断牙周炎的病情严重程度。

CD9和CD81为T细胞共刺激分子，可调控牙周炎免疫细胞的招募和迁移[35]。Tobón-Arroyave等[36]通过ELISA定量检测牙周炎患者唾液外泌体内容物，发现与健康受试者相比，CD9和CD81的含量大幅减少，且其含量与PPD和CAL等牙周炎临床指标呈负相关。目前，CD9和CD81在牙周炎中的作用机制尚未被完全阐明；有研究指出缺乏CD9和CD81可使巨噬细胞释放基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9，加速牙周组织破坏[37]；还有研究认为，富含CD9和CD81的唾液外泌体通过稳定CD14/TLR4复合物来下调脂多糖诱导的受体活化，阻碍牙周炎进展[38]。

综上，唾液外泌体中部分蛋白质可作为判断牙周炎病情的相关生物标志物，如PD-L1表达量增加、CD9和CD81表达量下降均可提示牙周炎病情仍在进展。熟悉牙周炎相关miRNAs及蛋白质的表达情况有助于临床医生精准判断患者病情，并为牙周炎患者个性化治疗提供依据。

4、外泌体在牙周炎治疗中的作用

外泌体可通过调节牙周炎症水平来延缓牙周炎进展。牙髓干细胞源性外泌体可促进巨噬细胞由促炎M1型向抗炎M2型转化[39]，有研究指出M2型巨噬细胞源性外泌体可通过IL-10/IL-10R途径改善小鼠牙周炎模型的炎症状态[40]。经三维细胞培养的间充质干细胞源性外泌体不仅通过miR-1246/Nfat5轴调节Th17/Treg细胞平衡，还可下调牙周炎中炎症因子的表达以减轻牙槽骨损伤[41]。

外泌体可用于修复牙槽骨缺损及促进牙髓牙本质再生。牙槽骨吸收是牙周炎患牙脱落的重要原因，临床治疗中可利用外泌体来修复牙槽骨缺损。Shimizu等[5]指出从人白细胞抗原单倍型牙髓细胞系中提纯的外泌体可刺激人牙髓细胞和小鼠成骨细胞迁移，在体外显著抑制小鼠破骨细胞的生成。Lei等[42]证明PDLSCs源性外泌体通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的过度激活，来促进牙周炎状态下牙周组织中的PDLSCs成骨分化，有助于修复牙周炎所致的牙槽骨缺损。人脱落乳牙源性外泌体不仅促进小鼠牙周炎模型中骨髓基质细胞分化和骨形成[43]，还可通过一磷酸腺苷活化蛋白激酶途径促进血管生成并修复牙槽骨缺损[44]。另外，重度牙周炎可累及牙本质牙髓复合体。Zhang等[45]指出永生化大鼠上皮根鞘系细胞源性外泌体可通过激活Wnt/β-catenin通路调节牙间充质干细胞分化，从而促进牙髓牙本质复合体再生。

外泌体还可作为药物的纳米载体用于牙周炎的靶向治疗。脂质体是目前常用的药物输送载体，但免疫相容性低、靶向能力弱的特点使其应用受到限制。与脂质体相比，外泌体体积小、免疫原性低、在体循环中存在时间长。外泌体具有丰富的跨膜蛋白和膜锚定蛋白，当外源性药物在与外泌体中的蛋白质及遗传物质结合后，可被定向递送至靶细胞发挥治疗作用[8]。Deng等[46]指出当胎盘间充质干细胞源性外泌体与水凝胶混合置入牙周炎小鼠牙槽骨缺损区时，其修复面积及新生骨小梁数目和厚度均较仅在牙槽骨缺损区置入水凝胶的对照组增加。Cui等[47]将搭载褪黑素的M2型巨噬细胞源性外泌体应用于牙周炎大鼠模型，发现患牙牙周组织的炎症水平降低，同时其牙槽骨缺损区的再生速度显著提升。此外，Luo等[48]成功构建了表面过表达C-X-C基序趋化因子受体4及内含miR-126的外泌体，并将其局部注射于牙周炎大鼠的患牙周围，发现牙槽骨的炎性吸收程度及破骨细胞数量下降，提示该外泌体可抑制牙周炎进展。

不同源性外泌体可延缓牙槽骨吸收，并通过调节牙周炎症水平、促进牙髓牙本质复合体再生及重建细胞外微环境来修复牙周炎所致的牙周组织损伤，还可作为纳米载体靶向递送药物。外泌体丰富的来源及结构可塑性为临床探究牙周炎的新型治疗机制和靶点提供广阔前景。

5、结语

目前牙周炎的临床诊疗仍面临早期确诊率低、初诊患者病情严重难以根治等问题，这可能与牙周炎的高发病率及牙周医生数量不匹配相关[49,50]。外泌体的应用有助于解决该问题。唾液外泌体液体活检可实现牙周炎在人群中的大规模诊断，并帮助了解牙周炎患者病情。此外，外泌体可通过调节细胞炎症水平、修复牙槽骨缺损、促进牙髓牙本质再生及靶向递送药物等机制参与牙周炎的治疗。外泌体在牙周炎的诊疗中应用前景广阔，但仍存在一些问题。目前常用的分离方法难以保证外泌体提纯物不掺杂如膜碎片等生物杂质，需对分析物进行亲和层析等纯化步骤，这将加大临床检测工作量。尽管近年来微流体技术的发展提高了外泌体等液体活检成分的使用效率，液滴数字PCR技术和下一代测序技术也提高了外泌体内含物的检出精度，但上述技术尚未大规模临床应用[51]。此外，外泌体半衰期短且易被单核吞噬细胞系统降解，在体内应用可能达不到预期疗效。无机或有机纳米颗粒与天然外泌体结合形成的仿生外泌体可能会提高其应用效果，但仍需进一步研究。

参考文献:

[33]朱德星,刘汾,戴芳,等.慢性牙周炎患者外周血T淋巴细胞表面程序性死亡分子1及其配体的表达[J].中华口腔医学杂志,2014,49(4):216-219.

基金资助:国家自然科学基金青年科学基金项目(NSFC31800114);

文章来源:罗文欣,任彪,黄睿洁.外泌体在牙周炎发生发展及诊疗中作用研究进展[J].中国实用口腔科杂志,2024,17(01):102-107.