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酸蚀牛牙釉质与酸蚀人牙釉质体外再矿化模型的比较研究

2024-04-25 115 上传者：管理员

摘要：研究抛光后、酸蚀后和体外再矿化后牛牙釉质(BE)与人牙釉质(HE)之间的差异。形貌分析表明，抛光BE的完整性优于HE,而HE的耐酸蚀性能和置于人工唾液(AS)中的自我修复能力优于BE。此外，在NaF的诱导作用下，酸蚀HE表面再生出平行排列、宽度约250nm、长度约3μm的类釉质棱晶样六方柱状晶体。经过相同的处理过程之后，酸蚀BE表面仅生成了长度约150nm、宽度约50nm的微小棒状晶体。尽管组成和结构相似，但体外再矿化结果显示这两种底物仍存在一定差异。因此，在选择牙釉质体外再矿化模型时，应对使用BE代替HE的过程进行全面评估。

关键词：
人牙釉质
再矿化
牛牙釉质
生命周期
生物材料
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牙釉质是脊椎动物最坚硬的组织，可以在整个生命周期中保持耐久性。牙釉质由平行排列的纳米级棱晶和与软蛋白基质交织的微米级釉柱组成[1,2]。与其他生物组织的多样性不同，这种结构序列在不同地质时代的不同物种中表现出惊人的一致性[3]。这种不变性表明不同物种的牙釉质之间具有相似的结构和功能基础[1,4]。

近年来，人牙釉质(HE)龋损的增长趋势使人牙成为许多研究中必需的体外模型。然而，立法的变化以及在获取人类组织方面的资源密集型问题，使得用非人类哺乳动物的替代品成为首选方案[5]。牛牙釉质(BE)的成分比其他物种更接近HE[6]。同时，与人牙相比，牛牙齿具有易于从屠宰场获得的优点，并且具有更均匀的牙釉质厚度和更大的表面积，从而易于抛光以达到标准化[7]。但目前关于这两种组织的组成和结构是否完全一致尚无共识。在牙釉质龋损/侵蚀/磨蚀研究中，使用BE替代HE的体外[8,9]和体内[10,11]研究提供了不一致的结论。

本研究研究了抛光后、酸蚀后和浸泡于人工唾液(AS)或AS+NaF中再矿化后BE和HE的表面形貌、表面组成和晶体结构，比较了这两种组织之间的体外再矿化差异，并提出了可能的机制。

1、实验材料和方法

1.1实验材料

NaN3,分析纯，福晨(天津)化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2实验方法

1.2.1牙釉质样品的制备和酸蚀脱矿

选择没有龋齿和损伤的完整黄牛磨牙，用刀片除去有机污染物并切掉根部，然后用DTQ-5型低速精密切割机切成3mm×4mm×2mm的釉质块，保留光滑的釉质侧面部分。使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)包埋釉质块，将暴露的釉质唇在水冷金刚砂盘上抛光，直至获得镜面状表面，经体视显微镜检查无明显划痕。将BE样品超声处理1min,并储存在4℃的磷酸盐缓冲液(PBS)中备用。

按照中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院的标准程序，收集由于正畸需要拔除的人第三磨牙。选择其中没有龋齿和损伤的完整磨牙，按上述抛光BE样品的制备程序，制备抛光HE样品。

制备含乳酸(0.1mol/L)和羧甲基纤维素钠(30g/L)的脱矿溶液，用1mol/L NaOH调节pH值至4.0。将牙釉质样品浸入脱矿溶液中，使釉质表面积与溶液的体积之比为2mm2/mL,并置于37℃的培养箱中12h以完成酸蚀脱矿。脱矿后，将样品超声处理1min,并储存在4℃的PBS中备用。

1.2.2力学性能分析

采用THV-30MD型维氏显微硬度计，测量9.8N载荷下牙釉质样品的表面显微硬度(SMH),保荷时间15s。在不同时间点(抛光后、酸蚀后和再矿化后),测量每个样品间隔200～300μm的3个点，取平均值。BE样品和HE样品均随机分为两组(n=6),样品的SMH数据表示为平均值±标准偏差。使用软件SPSS Statistics 24(USA),通过配对样品T检验比较BE和HE之间的SMH有无显著差异，P<0.05时认为有显著性。

1.2.3体外再矿化

制备含有CaCl2(1.5mmol/L)、KH2PO4(0.9mmol/L)、KCl(130mmol/L)和HEPES(20mmol/L)的人工唾液(AS),用KOH(0.1mol/L)调节pH=7,并添加NaN3(1.0mmol/L)以防止细菌生长。将牙釉质样品浸入装有60ml AS或60ml AS+0.15%(w) NaF的锥形瓶中，使釉质唇面朝上，然后将锥形瓶放在恒温振荡器(37℃)中振荡浸泡12h。用去离子水冲洗样品20s,然后置于37℃的新鲜AS溶液中继续振荡浸泡12h。依此循环共进行21d,每7d更换一次实验组AS或AS+NaF溶液。

1.2.4检测与表征

采用FEI Nova NanoSEM 450型场发射扫描电镜(FE-SEM)表征抛光BE和抛光HE在酸蚀前、酸蚀后以及再矿化后的表面和剖面形貌。FE-SEM表征之前，在釉质表面上溅射喷Au,时间为250s。釉质表面的Ca/P和Ca/F摩尔比通过能量色散X射线光谱法(EDX)测定，共测三个区域，并将数值表示为平均值±标准偏差。使用软件SPSS Statistics 24(USA),通过配对样品T检验，比较酸蚀前、酸蚀后以及再矿化后样品表面Ca/P的差异，P<0.05时认为有显著性。采用PANalytical Empyrean型X射线衍射仪(XRD)分析BE和HE表面的晶体类型和晶体结构，测试条件为CuKα,波长λ= 0.154056nm,步长0.02°,扫描速率4(°) / min,电压40kV,电流40mA。牙釉质表面的晶粒尺寸D(nm)通过Debye-Scherer公式计算：

2、结果与讨论

2.1牛牙釉质和人牙釉质的形貌对比

图1为抛光和酸蚀牙釉质的表面和剖面FE-SEM图。由图1可以看出，抛光BE的表面(图1(a))和剖面(图1(e))均呈现为完整而致密的形貌。相比之下，抛光HE的表面(图1(c))和剖面(图1(g))均存在一些微小的缺陷。在复杂的口腔环境中，HE经历了长年的机械磨损，叠加无数次脱矿和再矿化循环，最终导致其完整性低于BE。经酸蚀处理后，大量釉柱暴露出来，使BE表面呈鳞片状(图1(b))。由于釉柱间隙更容易受酸蚀的影响，从图1(b)中可以清楚地看到釉柱间空隙和取向分布的釉柱棱柱，同时大量釉质棱晶也暴露出来。如图1(d)所示，酸蚀后HE的釉柱间区域仅部分受到可见腐蚀，其耐酸蚀性能明显优于BE。在剖面形貌的比较中，这种趋势更加明显。BE的表层腐蚀深度约为35μm(图1(f)),HE的腐蚀深度约为15μm(图1(h))。从图1(f)放大图中可以看出，BE的棱晶纤维大量暴露出来，而HE的棱晶显示出相对完整的形态(图1(h))。人的寿命比牛的寿命长得多，因此HE的耐腐蚀性能可能是与进化过程中的长寿命相匹配的一种特殊性能。

图2为再矿化后牙釉质的表面和剖面FE-SEM图。从图2(a)可以看出，经AS处理的BE表面形貌仍存在较多缺陷，部分釉柱间隙未得到修复。同时，图2(e)表明AS对BE的深层修复作用较差，仅在表层部分生成了一些微小的晶粒。这些结果表明BE在AS中的自我修复能力有限。如图2(c)和(g)所示，酸蚀HE在AS中表现出较好的自我修复能力，脱矿产生的釉柱间隙和酸蚀的釉质棱晶均获得了理想的修复效果。同时，如图2(c)中放大图所示，无数直径约50nm的晶体沿HE表面经酸蚀活化的棱晶外延生长出来，说明在生理条件下酸蚀HE具有较好的再生能力。

置于AS+NaF中再矿化处理后，酸蚀BE表面呈现出完整而致密的形态(图2(b)),并附着有大量长约150nm、宽约50nm的棒状晶体。由图2(f)可见，酸蚀BE的深层损伤在经过AS+NaF处理后，得到一定程度的恢复。但与图1(e)所示抛光BE剖面形貌相比，仍然存在一些缺陷，可能归因于酸蚀BE深层脱矿区域有限的F-利用效率。从图2(d)和图2(h)中可以看出，酸蚀HE浸泡于AS+NaF中再矿化处理后，大量类釉质棱晶样六方柱状晶体沿垂直于酸蚀HE表面外延生长出来，这些平行排列的晶体宽度约为250nm、长度约为3μm。

Yin等[12]研究表明，在生理条件下，0.10M N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N′,N′-三乙酸+0.02M KF可以诱导酸蚀HE表面六方釉质样晶体的生成。但HEDTA有一定毒性。本研究结果证明，将酸蚀HE交替置于AS和AS+0.15%(w) NaF中时，也可以促进HE表面釉质棱晶样柱状晶体的再生。晶体外延生长的机制可能类似于先前的报道[12],酸蚀处理使HE表面产生活化的扭结作为成核位点，AS和AS+NaF中的Ca2+、PO43-以及F-在这些位置反应形成球形的无定形氟化磷酸钙(AFCP)颗粒，其热力学稳定性较差。当酸蚀HE经历多次再矿化循环后，这些AFCP转变为热力学更稳定的氟磷灰石(FAP)晶体，并形成六方釉质棱晶状晶体。

图1牙釉质表面和剖面FE-SEM图

图2再矿化后牙釉质表面和剖面FE-SEM图

2.2力学性能分析

图3为牙釉质表面力学性能的检测结果。由图3可知，抛光和酸蚀HE的SMH均高于BE相应值。配对样品T检验结果显示，AS再矿化处理过的HE,其SMH远高于AS再矿化处理的BE(P<0.05)。该结果与前述讨论的FE-SEM结果一致，说明酸蚀BE在AS中的自修复能力弱于酸蚀HE。

2.3表面XRD分析

图3A和图3B分别为BE和HE表面的XRD微区衍射图，所有图谱均与HAP的衍射峰一致(JCPDS,09-0432),表明BE和HE表面的成分均为HAP。尖锐的(002)峰表明牙釉质棱晶沿c轴取向排列，这一结果与图1和图2中的形貌分析一致。图3B曲线(d)中的(002)和(112)峰明显增强，表明用AS+NaF处理的HE,其表面新生成的六方晶柱具有较高的结晶度。

图3 BE和HE的SMH值对比

表1为通过Debye-Scherer公式计算得到的牙釉质表面晶粒尺寸数据。由表1可知，抛光后BE表面沿各晶向的晶粒尺寸均略高于HE对应值。而经酸蚀、AS或AS+NaF处理的HE,沿垂直于(002)和(112)晶面的晶粒尺寸均大于BE相应数值。这一实验结果再次证明HE的耐酸蚀性能和自我修复能力优于BE。

图4 BE(A)和HE(B)的XRD图谱

表1牙釉质表面晶粒尺寸

2.4表面元素分析

表2为通过EDX分析得到的牙釉质表面Ca/P和Ca/F摩尔比。抛光HE表面的Ca/P与经验衍生的HAP(Ca/P=1.67)十分接近。而抛光BE表面的Ca/P低于抛光HE的相应值，表明抛光BE表面含有缺钙HAP晶体。同样，经酸蚀处理后，HE表面的Ca/P也显著高于BE。经AS+NaF处理的BE,其表面Ca/P显著高于抛光样品，且Ca/F约为5.00,表明BE表面的矿物成分为FAP。而AS+NaF处理的HE,其Ca/F高于BE,这可能是由于HE表面新生成的釉质样棒状晶体所含羟基被更多的F-取代所致。

表2牙釉质表面Ca/P和Ca/F摩尔比

3、结论

本研究对比了酸蚀牛牙釉质与酸蚀人牙釉质两种体外再矿化模型，通过FE-SEM形貌分析、力学性能检测、XRD微区衍射和EDX分析等手段，分析了两种体外再矿化模型的共性和差异。研究发现：

①抛光BE与抛光HE在结构和成分组成等方面相似，BE的完整性优于HE,而HE的耐酸蚀性能优于BE;

②酸蚀BE在AS中的自我修复效果较差，SMH值恢复有限。酸蚀HE经AS再矿化处理后，形貌和SMH均得到了良好修复；

③经AS+NaF再矿化处理后，酸蚀BE表面仅生成了长度约150nm、宽度约50nm的微小棒状晶体，而酸蚀HE表面再生出宽度约为250nm、长度约为3μm的类釉质棱晶样棒状六方晶体，说明酸蚀HE对F-的利用效率高于酸蚀BE;

④在选择酸蚀牙釉质体外再矿化模型时，应根据实际的需求，全面评估是否可以用BE替代HE。

文章来源:刘继涛,邬凤娟,唐伟月.酸蚀牛牙釉质与酸蚀人牙釉质体外再矿化模型的比较研究[J].口腔护理用品工业,2024,34(02):27-30.