沙门菌(Salmonella)是引起食源性疾病的重要病原菌之一，其中以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌最为常见。据中国细菌耐药监测网数据显示，在2005—2014年间，哨点医院分离出的3 478株沙门菌中，鼠伤寒沙门菌占27.4%,肠炎沙门菌占24.4%,其他血清型的非伤寒沙门菌占比低于2.6%[1]。在我国沙门菌感染占细菌性食源性疾病暴发的70%以上[2],对沙门菌感染重症患者的治疗主要依靠抗菌药物，但由于近年抗生素的广泛使用，沙门菌的耐药情况日益严重，20世纪90年代沙门菌的多重耐药率仅为20%,21世纪初已急速上升至70%,同时对喹诺酮类及三代头孢等抗生素也出现了耐药现象[3,4]。

随着全球商业的高速发展，跨区域的食品贸易大大增加了食品的流动性，从而导致了现在的沙门菌食源性疾病呈现出更为复杂的特点，传统的血清学分型鉴定已不能满足由沙门菌引起的食源性疾病的流行病学调查与溯源要求，而脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)因其在研究细菌分子分型同源性方面有着明显优势，现已被广泛运用于多种病原体暴发流行的溯源分析中，被国际公认为区分暴发菌株和分子溯源的金标准[5]。本研究对云南省87株病原性鼠伤寒沙门菌进行分子分型和耐药研究，为疾病防控和临床用药提供技术依据。

1、材料与方法

1.1菌株来源

实验菌株分离自云南省2020年1月—2021年12月食源性疾病主动监测哨点医院感染患者，经生化血清、质谱鉴定复核为鼠伤寒沙门菌后进行PFGE分型和药敏试验。

1.2培养基及试剂

沙门菌培养基和生化试剂(北京陆桥技术股份有限公司),SSI沙门菌诊断血清(丹麦国家血清研究院),VITEK2全自动微生物鉴定系统GN鉴定卡(法国生物梅里埃公司),限制性内切酶XbaⅠ(日本TaKaRa BIO INC),蛋白酶K(德国默克公司),革兰阴性需氧菌药敏板(美国赛默飞世尔科技公司及上海星佰生物技术有限公司),均在有效期内使用。

1.3主要仪器设备

VITEK2全自动微生物分析系统(法国生物梅里埃公司),基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(德国布鲁克公司),CHEF-MAPPER脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像系统(美国伯乐公司),全自动药敏试验菌液接种仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.4实验方法

1.4.1菌株复核

将分离到的沙门菌菌株用VITEK2全自动微生物分析系统及飞行时间质谱仪进行复核确认。依据沙门菌血清型属White-Kauffmann Le Minor抗原表[6],用沙门菌诊断血清确定血清型。

1.4.2 PFGE分型

根据中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络Pulse Net China的沙门菌PFGE分子分型方法，将87株鼠伤寒沙门菌进行包埋、裂解、洗涤后，用XbaⅠ酶切，用CHEF-MAPPER将得到的DNA片段进行PFGE分型，最后使用BioNumerics 7.6软件处理成像图谱进行聚类分析。

1.4.3药敏试验

根据美国临床与实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI)推荐的微量肉汤稀释法进行药敏试验，得到敏感(S)、中度敏感(I)和耐药的结果(R)。每次试验均采用国际标准株粪肠球菌ATCC 29212、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞ATCC 27853作质控对照。质控菌株均购自中国工业微生物菌种保藏中心。

2、结 果

2.1 PFGE分子分型结果

聚类分析结果显示，87株鼠伤寒沙门菌PFGE图谱相似度为68.1%～100.0%,菌株间相似度100.0%视为同一PFGE带型。87株鼠伤寒沙门菌共分为65种带型，分别命名为T01-T65,根据图谱的成簇现象，自上而下分为3个簇，分别命名为A(T01-T34)、B(T35-T46)、C(T47-T65),其中T01带型有4株，T03带型有10株，T08、T36、T39三种带型皆有3株，T06、T10、T12、T35四种带型皆有2株，剩余56种带型均为1株。65种带型中，T03为优势带型，该带型10株菌之间相似度为100.0%,见图1。

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图1 87株鼠伤寒沙门菌PFGE聚类谱图及耐药谱图  下载原图

注:1.耐药谱中的高、中、低方块分别表示耐药、中度敏感、敏感；2.红霉素虽全程参与实验但无折点判断标准，故未参与计算结果。

2.2分子分型与药敏的相关性

从PFGE图谱和耐药谱对比来看，PFGE带型相似度较高的菌株(例如同一簇)的耐药谱也呈现出较高的相似度，但PFGE带型100%相同的各菌株之间的耐药谱却不尽相同，如T03带型中10株菌，有10种耐药谱，无一相同，同样T01带型中4株菌，有4种耐药谱，无一相同。但也存在PFGE带型相同耐药谱相同的情况，比如，T08带型中3株菌有2种耐药谱，其中2株菌T08-1、T08-3既有相同的PFGE条带，又有相同的耐药谱，T036的3株菌也存在同样的情况，T36-1和T36-2有着相同的PFGE带型和耐药谱，见图1。

2.3药敏实验结果

选择15种抗生素对鼠伤寒沙门菌进行药敏试验，抗生素包括：环丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)、萘啶酸(NAL)、庆大霉素(GEN)、四环素(TET)、头孢噻肟(CTX)、头孢西丁(CFX)、氨苄西林(AMP)、氨苄西林/舒巴坦(AMS)、头孢他啶(CAZ)、头孢唑啉(CFZ)、亚胺培南(IPM)、阿奇霉素(AZM)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(SXT)、多黏菌素E(CT)。

2.3.1对15种抗生素的耐药情况

将87株鼠伤寒沙门菌同时进行15种抗生素的耐药实验，有8株对所有测试的抗生素敏感，其余的79株菌对测试的抗生素均表现出不同程度的耐药，其中，对氨苄西林的耐药率最高，为79.3%;其次为氯霉素(65.5%)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(63.2%)、头孢唑啉(56.3%)、氨苄西林/舒巴坦(49.4%)。87株鼠伤寒沙门氏菌对头孢西丁最为敏感，耐药株为0,敏感率为98.9%;其次，对阿奇霉素(95.4%)、多黏菌素E(95.4%)、庆大霉素(92.0%)、头孢他啶(87.4%)、萘啶酸(86.2%)、头孢噻肟(83.9%)、亚胺培南(83.9%)等抗生素普遍敏感，见表1。

表1 87株鼠伤寒沙门菌对15种抗生素的耐药情况

2.3.2多重耐药情况

对三类及以上抗生素耐药的菌株判定为多重耐药。本次试验的87株鼠伤寒沙门菌中，有69株为多重耐药，多重耐药率为79.4%。其中，有2株菌对测试的15种抗生素中的12种皆显示耐药，多重耐药谱中，同时耐6种抗生素CHL+TET+AMP+AMS+CFZ+SXT的耐药组合占比最高，有10株；其次为同时耐4种抗生素CHL+TET+AMP+SXT的耐药组合，有8株，见表2。

表2 87株鼠伤寒沙门菌多重耐药谱

3、讨 论

本研究对云南省87株鼠伤寒沙门菌进行PFGE分子分型研究，根据聚类分析图谱，87株鼠伤寒沙门菌有较好的成簇现象，大致分为3簇，自上而下命名为A(T01-T34)、B(T35-T46)、C(T47-T65),相似度依次为76.6%～100.0%、70.5%～100.0%、73.1%～100.0%。按照100%相似度，87株鼠伤寒沙门菌可分为65种带型，分别命名为T01-T65,其相似度为68.1%～100.0%。根据图谱带型，A簇各菌株间同源性较高，除去T31、T32、T33、T34四种型别以外，其余型别相似度高达85.3%,提示此类型别的菌株间关系紧密，尤其T01(4株)、T03(10株)、T08(3株)等型别分别包含多株相似度100%的无差异同源株，提示该类基因型来自相同克隆株，有共同的暴露来源。其中，优势带型T01-1、T01-2和T03-5～T03-7同时在2020年6—8月间出现在玉溪地区，这几株沙门菌有着明显的时间性、地域性的聚集特征，提示玉溪地区可能发生过鼠伤寒沙门菌的聚集性暴发。同时，该型别的菌株(T03-1～T03-4)也在2020年7—10月间分别出现在普洱、大理、怒江和文山等地区，又在2021年4—7月间出现在大理(T01-3、T01-4)、文山(T03-8)、昆明(T03-9)和曲靖(T03-10)等地区，说明此类亲缘关系相对集中的鼠伤寒沙门菌，已经在全省范围内形成了长期广泛的传播链；B簇17株菌，有10株来自昆明市，另外7株分别来自普洱市(1株)、保山市(2株)、曲靖市(2株)、玉溪市(1株)、文山壮族自治州(1株),从聚类相似度来看，包含3组相似度100%的同源株，T35(2株),分别来自普洱和昆明，T36(3株),1株来自保山，2株来自昆明，T39(3株)均来自昆明，提示昆明地区可能暴发过相关基因型菌株引起的疾病，导致该型别在昆明地区广泛流行，并形成了跨地区的同源株传播；C簇19株菌，呈现19种条带型别，而并未呈现出时间、地域的聚集性，说明该簇型别来源广泛，在全省多地呈散发流行。

抗生素是治疗食源性细菌感染的基本药物，临床上一般将氟喹诺酮类药物用于治疗成人感染沙门氏菌，而头孢菌素类抗生素则是临床治疗儿童沙门菌感染的首选药物[7],而近年抗生素的滥用导致大量细菌产生了耐药性。本研究显示，87株鼠伤寒沙门菌，有高达90.8%的菌株均表现出不同程度的耐药性，而仅有9.2%的菌株对15种抗生素完全敏感。其中，对氨苄西林的耐药率最高，达到79.3%,这与我国江苏省[8]、山西省[9]和广西壮族自治区[10]的相关研究结果基本一致。更为严重的是鼠伤寒沙门菌的多重耐药情况，研究结果显示，多重耐药率高达79.4%,这一数据高于江苏省报道的67.4%[8]、广西壮族自治区报道的42.31%[10]和辽宁省报道的55.1%[11],并且出现了明显的优势耐药谱，耐6种抗生素CHL+TET+AMP+AMS+CFZ+SXT组合和耐4种抗生素CHL+TET+AMP+SXT组合，分别有10株和8株。耐5种及以上抗生素的有46株，占52.8%,并且出现了2株同时耐12种抗生素的鼠伤寒沙门菌，这些结果提示目前云南省鼠伤寒沙门菌的耐药情况已不容乐观。由于沙门菌的耐药基因一般位于转座子，移动整合子和插入序列中，即使排除抗生素的选择压力，高度耐药沙门菌的耐药基因也会通过基因转移来传播耐药性[12]。根据杨柳青等[13]的研究结果，相比其他血清型，鼠伤寒沙门菌更易对抗生素耐药，同时，其多重耐药性也较其他血清型沙门菌更高。因此，云南省鼠伤寒沙门菌的耐药情况需要引起高度关注，多重耐药的原因值得深入探究。为有效遏制耐药性传播提供技术支持，同时，多部门协作监测人源和食源性沙门菌的耐药情况已刻不容缓。

本次药敏研究结果与2016—2017年云南省鼠伤寒沙门菌耐药监测情况有较大出入，田云屏等[14]研究报道2016—2017年云南省鼠伤寒沙门氏菌耐药率最高的是甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(45.59%),第二是氨苄西林/舒巴坦(38.24%),第三是头孢唑啉(23.53%),而氨苄西林的耐药率仅为1.47%,同时敏感率最高的抗生素则是亚胺培南，其次为氨苄西林、四环素、头孢噻肟、阿奇霉素，但2016—2017年鼠伤寒沙门菌的多重耐药率仅为23.53%。两年时间云南省鼠伤寒沙门氏菌的耐药情况发生如此巨大的变化，氨苄西林从敏感变成了耐药，多重耐药率从23.53%升高到79.3%,推测可能的原因有，该类抗菌药物长期广泛使用和耐药基因在细菌种间和沙门菌种内传播导致耐药谱不断增宽和耐药性不断增强，也有可能与临床用药政策的变化有关，具体原因有待研究。

从PFGE图谱和耐药谱对比来看，细菌分子分型与耐药谱之间存在一定关联，PFGE带型相似度较高的菌株(例如同一簇)的耐药谱也呈现出较高的相似度，但PFGE带型100%相同的各菌株之间的耐药谱却不尽相同，如T03带型中10株菌，呈现出10种不同的耐药谱，虽然高度相似，却无一相同，同样，T01带型中4株菌，也有4种不同的耐药谱。存在PFGE带型相同耐药谱也相同的情况，比如，T08带型中3株菌有2种耐药谱，其中2株菌T08-1、T08-3既有相同的PFGE条带，又有相同的耐药谱(CHL+TET+AMP+SXT);T036的3株菌也存在同样的情况，T36-1和T36-2有着相同的PFGE带型和耐药谱(0耐)。也有PFGE带型不同而耐药谱却完全相同的情况，T29和T31,基因相似度为80.8%,耐药谱同为4耐组合CHL+TET+AMP+SXT,T32、T33、T34三株菌带型不同也有同样的耐药谱(CHL+TET+AMP+AMS+CFZ+SXT),T42和T43带型，耐药谱同为5耐组合NAL+TET+AMP+AMS+CFZ。由此可见，部分鼠伤寒沙门菌的PFGE带型与耐药表型呈现聚类一致性，此类情况与国内相关研究报道一致，菌株的PFGE带型与耐药表型确实存在一定程度的关联性[15,16,17],但又并非完全吻合，原因可能是某些非保守的耐药基因发生了突变，但突变位点与PFGE酶切位点并非一致，导致菌株PFGE分型不能准确表现出菌株的耐药情况[18]。

沙门菌是全球四大腹泻致病菌之一[19],本研究结果显示，云南省鼠伤寒沙门菌PFGE型别既表现出明显的遗传多样性，也存在明显的优势带型，某些优势带型的菌株已经出现了全省范围内跨地区传播的情况。同时，耐药情况也比较严重，尤其氨苄西林的耐药程度以及整体多重耐药的情况，提示有关部门应协同合作，加强监管，临床在用药选择上应予以重视，以防止细菌耐药性增强，耐药谱增宽。PFGE分子分型不仅可以表达菌株之间亲缘性，追溯污染源，结合长期的药敏监测数据，还可以协助分析菌株的耐药趋势，对指导临床用药选择以及遏制细菌耐药率上升有着重要意义。

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基金资助:云南省重大科技专项计划(202002AE320005);

文章来源:王慧雯,邹颜秋硕,杨祖顺等.鼠伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳分子分型及耐药分析[J].实用预防医学,2023,30(08):932-936.