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浅谈响应面法应用于绿色木霉产胶霉菌素培养基的优化

2020-03-02 286 上传者：管理员

摘要：本研究通过MinRunResIV设计，快速地有效从绿色木霉产胶霉菌素基础培养基的6个影响因素中筛选出4个显著性影响因素：葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾和硫酸锌，然后利用最陡爬坡实验接近最大响应中心并用CentralCompositeDesign设计得岀最佳培养基组合；在最佳培养基组合下，绿色木霉产胶霉菌素效价达到80.22mg/100mL, 且较优化前胶霉菌素效价提高了59.71%。

关键词：
中心组合试验
响应面分析
培养基
最陡爬坡试验
胶霉菌素
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胶霉菌素(gliotoxin)是环缩二氨酸类物质it,WeindlingandEmerson首次将这种物质从Trichodermalignorum中分离岀来，后来weindling将这种物质定义为胶霉菌素曰；胶霉菌素(gliotoxin)具有广谱抑菌旳、抑病毒叭抗肿瘤冋、免疫调节活性佝和诱导细胞凋亡叩等作用，胶霉菌素已经被应用于抗肿瘤药物的研制，其作为防治土传病害的生物农药也正在被研究，有很好的应用前景。但其产率较低,生产成本高限制了大规模生产使用。因此，本实验室分离1株绿色木霉(7Hc/ode/Tnavirens)高产胶霉菌素高产菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO.561k在前期单因素试验和正交因素试验筛选培养基工作的基础上，利用响应面分析优化培养基，以提高胶霉菌素产量。

1、材料与方法

1.1 试验时间、地点试验

于2017年2月—2018年5月在黄河三角洲京博化工研究院有限公司进行。

1.2 试验材料

1.2.1 菌种所用的绿色木霉菌株由本实验室分离得到。

1.2.2 培养基及培养条件

(1)种子培养基。加入20g/L葡萄糖的200g/L土豆汁，pH值自然，500mL摇瓶装液量100mL,28°C,170r/min培养48h.

(2)基础发酵培养基。葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、豆粕10g/L,磷酸二氢钾0.5/L、硫酸锌0.1g/L、硫酸亚铁0.1g/L、pH6.0,500mL摇瓶装液量100mL,接种量5%(v/v),28°C,170r/min培养48h。

1.3 胶霉菌素效价的测定

高效液相进行胶霉菌素效价检测，摇瓶发酵完成的发酵液100mL,加入50mL分析纯乙酸乙酯,170r/min摇床震荡2h,离心后吸取上清液5mL,吹干后加入5mL分析纯甲醇溶解，用外标法绘制胶霉菌素标准曲线，根据峰面积计算发酵液胶霉菌素效价。

1.4 发酵培养基的优化

1.4.1 MinRunResIV试验设计Design-Expert8.0的MinRunResIV试验设计：通过改变各试验因子较少水平，筛选对试验结果具有显著影响的试验因子。本试验利用该设计分别添加基础发酵培养基各成分的2个水平：葡萄糖(A)、酵母粉(B)、豆粕(C)、磷酸二氢钾(D)、硫酸锌(E)、硫酸亚铁(F),考察基础发酵培养基各成分对胶霉菌素效价影响的显著性，试验设计见表1。

1.4.2 最陡爬坡试验根据MinRunResIV试验设计确定对胶霉菌素效价影响的显著性因子，以拟合的多元回归方程确定显著影响因素的爬坡方向和步长，以确定其取值中心。

1.4.3 响应面分析根据最陡爬坡试验确定显著影响因子的取值中心，釆用中心组合设计(CentralCompositeDesign,CCD)，每个因素取5个水平：中心点、士1、土2。

1.4.4 模型验证根据响应面分析预测的模型最大值进行验证。

1.5 统计分析

采用Design-Expert8.0进行数据处理与分析。

2、结果与分析

2.1 显著影响因子的确定

MinRunResIV设计及响应值见表1,方差分析结果见表2,得到的回归方程(1)。

R=5&89+5.39X+0.38B+3.34C-195Z)-2.22E-0.60F.....................................................(1)

模型相关系数疋=0.9381,所选模型显著。表2中PV0.05为显著影响因子，可看出葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾、硫酸锌为显著影响因子，且葡萄糖、豆粕表现为正效应，磷酸二氢钾、硫酸锌为负效应，以此确定显著影响因子的爬坡方向。

2.2 中心组合设计中心点的确定

选取葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾和硫酸锌4个影响显著的因子，进行最陡爬坡试验，显著因素的变化方向、步长和响应值见表3。由表3可知，第3组试验葡萄糖26g/L、豆粕16g/L、磷酸二氢钾0.4g/L和硫酸锌0.06g/L胶霉菌素效价最高。因此，以第3组的水平作为中心组合设计试验显著影响因子取值的中心。表3最陡爬坡试验设计及响应值。

2.3 中心组合设计及响应面分析

根据最陡爬坡试验确定显著影响因子的取值中心，运用DesignExpert8.0软件中的CentralCompositeDesign中4因素5水平的试验设计，中心组合试验设计及响应值见表4,回归分析结果见表5,经拟合得到二次回归数学模型(2)。

2=79.65+2.2841.48C+2.55D-1.44E+0.63/4C+0.63AD+2.15&E+0.89CD+2.24CE-0.042DE-3.99-4.25(^-4.98^-6.77^2..................................................(2)

模型相关系数疋=0.9635,说明模型拟合较好。葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾和硫酸锌4个显著影响因子对胶霉菌素效价的影响，见图1。运用DesignExpert8.0软件对回归方程进行优化的结果为：葡萄糖26.54g/L、豆粕15.72g/L、磷酸二氢钾0.452g/L和硫酸锌0.0582g/L,预测胶霉菌素效价最高80.46mg/100mLo从响应面三维和等高线图可以看出，葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾和硫酸锌交互作用较好，胶霉菌素效价最佳预测点80.46mg/100mL在试验范围内，可以此二次回归模型模拟培养基葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾和硫酸锌的最优取值。

2.4 模型验证

根据二次回归模型模拟培养基显著影响因子的最优取值,对模型进行3次试验验证,胶霉菌素效价分别为:79.23mg/100mL、79.89mg/100mL、81.53mg/100mL,平均为80.22mg/100mL,与预测值80.46mg/100mL相当。说明响应面分析得到的最优发酵培养基与预测结果相符合，且较优化前胶霉菌素效价50.23mg/100mL相比提高了59.71%。优化后得到的绿色木霉产胶霉菌素培养基为：葡萄糖26.54g/L、酵母粉10g/L、豆粕15.72g/L、磷酸二氢钾0.452g/L和硫酸锌0.0582g/L、硫酸亚铁0.1g/Lo3讨论与结论培养基优化的常用方法有单因素和正交试验设计。单因素试验设计只考虑某一因素的影响，正交试验设计只能得到最佳因素水平的组合，都没有研究因子之间的相互作用；响应面分析法用于研究多因子之间交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件"叫国内外不少学者通过响应面分析法在培养基优化方面取得了显著成绩”如。本研究通过MinRunResIV设计，快速地有效从绿色木霉产胶霉菌素基础培养基的6个影响因素中筛选出4个显著性影响因素：葡萄糖、豆粕、磷酸二氢钾和硫酸锌，然后利用最陡爬坡实验接近最大响应中心并用CentralCompositeDesign设计得岀最佳培养基组合：葡萄糖26.54g/L、酵母粉10g/L、豆粕15.72g/L、磷酸二氢钾0.452g/L和硫酸锌0.0582g/L、硫酸亚铁0.1g/L。在最佳培养基组合下，绿色木霉产胶霉菌素效价达到80.22mg/100mL,与预测值相当，说明响应面法优化绿色木霉产胶霉菌素是有效的，且较优化前胶霉菌素效价提高了59.71%。对于绿色木霉产胶霉菌素的发酵条件如温度、转速、接种量还需继续优化,在发酵培养基与发酵条件确定后，才能为大规模应用奠定基础。

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