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基于库尔特原理的斑马鱼胚胎细胞检测系统

2024-11-04 78 上传者：管理员

摘要：细胞的机械性能与其生理状态和功能密切相关，本文基于库尔特原理研制了细胞检测系统。以斑马鱼胚胎细胞为检测对象，设计制作了带有收缩结构的微流控通道，利用检测系统测量细胞通过微收缩通道时通道两端的阻抗变化，通过记录信号幅值变化与通过时间来表征细胞电学特性与力学特性。实验结果证明：在低频信号下，该系统测得其通过收缩通道引起的幅值与时间变化主要取决于细胞体积大小，验证了健康斑马鱼胚胎细胞具有绝缘特性，并根据斑马鱼胚胎细胞膜的选择透过性与细胞活性的关系，实现了对斑马鱼胚胎细胞的活性检测；在高频信号下，对斑马鱼胚胎细胞进行跟踪检测，结果表明3个不同生长阶段下测得电压幅值变化具有明显差异。

关键词：
库尔特原理
微弱信号
微通道
斑马鱼胚胎细胞
检测电路
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库尔特原理是一种基于阻抗的检测方法，可以实现基本的细胞计数功能[1]。随着微纳米制造技术的快速发展，基于库尔特原理的电阻式传感器已成为检测和计数悬浮粒子或细胞的重要手段[2]。

细胞的生物化学和机械力学性能是生物物理学、医学以及基础生物学领域的重要研究方向[3]。近年来，越来越多的研究表明，细胞的机械性能与其生理状态和功能密切相关，人体患病后细胞器结构的改变会导致细胞机械性能的变化[4]。经研究发现，在感染疟疾或患镰刀型贫血症后，人体内红细胞的硬度明显高于正常红细胞，这导致它们在穿越血管壁时受阻[5]。因此，对细胞机械性能的表征不仅可以反映细胞的生理功能状态，而且有望成为早期疾病诊断的一种有效手段。

本文基于库尔特原理的交流阻抗法开展了斑马鱼胚胎细胞检测。利用设置在收缩通道内的电极对通过的细胞进行阻抗测量，通过分析不同频率下的阻抗变化引起的电压信号改变与细胞通过收缩通道的时间关系，对细胞体积、活性、生长阶段进行了检测，并将检测结果用光学显微镜与电化学工作站进行验证，证明了本文检测系统的准确性和可靠性。

1、细胞检测原理

当粒子通过一个浸入电解液的绝缘孔时，它会置换电解液并改变电阻，借助位于孔两侧的电极检测其电阻变化，如式(1)所示。其中，Rt为管的电阻，Dt为直径，Lt为长度，ρm为填充电解液的电阻率[6]

这种电阻变化体现为电压脉冲变化。每个脉冲对应一个单一粒子通过，脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目呈线性对应关系[7]。

常规库尔特直流电阻脉冲检测系统中电解液的极化效应会导致电极阻抗的增加，从而降低系统的灵敏度，且直流电阻检测只能表征细胞的尺寸信息，无法分析细胞的内部电学特性[8,9]。为了克服上述缺陷，交流阻抗检测应运而生。通过施加交流信号源对特定的对象进行检测，可以根据检测区域内的电信号来反映细胞膜、细胞质等信息[10]。当施加低频交流信号时，细胞膜表现为一种带有电容效应的绝缘体，因此可以通过测量细胞的电压幅值来反映细胞体积的信息。当施加高频交流信号时，细胞膜的阻抗作用显著降低，使得电信号可以穿透部分细胞膜和细胞内液，此时测得的电压幅值反映了细胞体积和内部信息。

2、检测系统设计

检测系统由带有收缩结构的微流控芯片、信号调理模块、激励源、锁相放大器、信号采集电路、上位机以及铂电极等组成。

检测系统结构示意如图1所示。激励信号通过中间的电极施加，两端的电极对称分布于通道两端并连接差分和前置放大器，信号经过放大滤波后进入锁相放大器，处理后的信号送入单片机采样，并传送给上位机显示。

图1 检测系统结构

2.1 硬件设计

检测系统的硬件电路包括激励源、信号调理(差分和前置放大、低通滤波)、锁相放大和模/数(A/D)转换电路等。

当使用直流信号作为激励信号时，在电极之间会由于极化反应而带来较大的测量误差。研究表明，频率越低的激励信号，会给测量结果带来越大的误差[11,12]。当激励信号频率高于2 kHz时，测试结果趋于稳定，具有更高的可信度。本文选择高速函数发生器MAX038为信号源用以提供正弦激励信号，经过两级运放后，激励信号发生电路可以输出频率范围为2 kHz～2 MHz, 幅值范围为2～5 Vpp 的正弦激励信号。差分放大电路采用RC滤波、电压跟随器与差分放大器组合而成，差分放大电路的主要作用是对输入信号做差分并进行信号放大操作，消除周围环境因素对检测信号的干扰；选用OPA376AIDBVR为核心芯片构成前置放大电路；低通滤波器采用以NE5532为核心芯片构成的四阶低通滤波器。选用AD630芯片组成锁相放大电路，将有效信号从背景噪声中提取出来并还原。选用STM32F103C8T6作为中央控制芯片，并利用其模数转换功能对信号进行采样处理。

2.2 上位机设计

上位机采用Visual Studio平台开发。上位机接收串口数据并对数据进行处理，在检测时实时显示细胞通过时的电压变化，通过chart函数绘制电压幅值的实时变化曲线，以便于直观的观测由阻抗变化引起的电压幅值改变趋势。

3、材料选型与制作

3.1 细胞选型

斑马鱼是研究胎儿生长发育分子机理的重要优质来源，斑马鱼遗传基因近30 000种，与人类基因的接近率超过87 %,这表明使用斑马鱼胚胎细胞做实验所获得的产物在大部分情形下与人体实验产物相同，是探讨外部条件影响下生物细胞生长发育作用的优质实验模型[13]。健康的斑马鱼胚胎细胞具有完整的细胞膜与核膜，呈透明状。本文后续实验采用斑马鱼胚胎细胞来进行细胞检测。

3.2 收缩通道的设计与制作

借助实验室在前期工作中设计制作的电动拉针仪，通过加热拉伸将外径1.3 mm的毛细管制作成具有800 μm收缩外径的玻璃毛细管作为模具使用。

将聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)主剂与固化剂按10︰1的比例预先混合，经过搅拌、抽真空后倒入安放有收缩孔径毛细管的容器中，用以制作PDMS流路通道。此外，将适量的PDMS倒入制作的方形模具中，该方形模具底部加工有3条平行且等间距的线形凸起结构，凸起长度为1 mm, 高度与宽度均为200 μm, 以此制作具有电极凹槽结构PDMS基底。将上述两组PDMS结构体加热固化后，将其从模具上剥离出来，经过切割、清洗等操作后，借助等离子清洗机(塞奥特光电技术有限公司，YZD08—2C)进行化学键激活，完成激活后将通道与电极凹槽基底对准键合，然后将铂电极插入凹槽中，再用PDMS预聚物进行密封和固定，如图2中左上角放大视图所示。

3.3 整体检测系统搭建

整体细胞检测系统如图2所示，图中左侧为数字注射泵，提供稳定的压力将斑马鱼胚胎细胞注入通道中。利用硅胶导管将注射器与微流控芯片连接，微流控芯片内包括微收缩孔径结构和检测电极。将电极与检测电路连接，由检测电路对由细胞阻抗变化引起的电压幅值变化信号进行调制，并将测得的电压信号传送给单片机，再由上位机对其进行信号处理与波形绘制，并记录数据。图中的光学显微镜可以观测胚胎细胞的体积信息，并观察细胞的实时流动状态，借此对电极检测结果进行验证。

图2 整体细胞检测系统

4、斑马鱼胚胎细胞检测

4.1 细胞体积检测

在进行细胞参数检测前，首先使用分析纯(analytical reagent, AR)级乙醇冲洗微流控芯片微通道，然后使用0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐溶液冲洗并填充微流控通道，选取20枚不同直径的健康斑马鱼胚胎细胞，用数字注射泵依次通入微流控芯片，在10 kHz、5 Vpp的低频正弦信号激励下，通过微收缩孔径时引起信号电压幅值变化，并记录通过收缩通道的时间，得到胚胎细胞直径(借助显微镜测量)与测得电压幅值变化关系，所得数据为3次重复测量的平均值。如图3所示，随着细胞直径的增大，微通道内细胞通过收缩孔径时所测得电压幅值也增大，说明了微通道内的电阻抗变化随细胞直径大小呈线性变化。

对胚胎细胞进行检测的同时，记录细胞通过整个电极区域的时间T,如图4所示，随着细胞直径的增大，微通道内细胞通过收缩通道的时间增大，细胞通过收缩通道的时间与细胞直径大小呈近似线性相关。

图3 电压幅值与细胞直径关系

图4 细胞通过收缩通道时间与细胞直径关系

对比低频信号下测得胚胎细胞通过收缩通道时的幅值变化以及通过收缩通道的时间，验证了斑马鱼胚胎细胞在低频信号下具有绝缘特性，测得幅值变化大小主要取决于体积大小。

4.2 细胞活性检测

斑马鱼健康胚胎细胞与死亡细胞目视情况下区别不大，但电学参数变化明显，可以借助此特性进行细胞的活性检测。健康的斑马鱼胚胎细胞在低频信号下体现出绝缘特性。而死亡斑马鱼胚胎细胞的细胞核膜已破裂，细胞膜失去选择透过性，整体呈浑浊状，并且细胞在低频信号下不再具有绝缘特性。

首先使用AR级乙醇冲洗微流控芯片微通道，然后用0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐溶液冲洗并填充通道，在10 kHz、5 Vpp的正弦激励信号下，选取20个健康细胞与20个已死亡的斑马鱼胚胎细胞进行检测对比，如图5(a)所示，正常胚胎细胞在通过收缩通道时，测得幅值均值为294.62 mV,而已死亡斑马鱼胚胎细胞通过收缩通道时，测得幅值均值仅为8.25 mV,这是由于死亡细胞由于细胞膜功能不完整导致其绝缘性能丧失，整体幅值信号十分微弱。

在通过收缩通道时，正常胚胎细胞通过通道的时间均值为3.46 s, 死亡胚胎细胞通过收缩通道的时间均值为1.22 s, 如图5(b)所示，死亡斑马鱼胚胎细胞体现出较差的机械性能，且在通过收缩孔径时在通道的挤压下细胞发生近似不可逆的形变，回弹性变差。

图5 健康细胞与死亡细胞的幅值和通过时间对比

4.3 生长阶段检测

以斑马鱼产卵后，即刻收集斑马鱼胚胎细胞的时间作为初始时刻，胚胎细胞呈现stage1体节期的状态，如图6(a)所示；培养12 h后进行观察，胚胎细胞呈现stage2咽囊期状态，如图6(b)所示；30 h后观察，胚胎细胞呈现stage3孵化期状态，如图6(c)所示。随着斑马鱼胚胎逐渐发育，胚胎细胞直径随着发育逐渐增大，细胞质明显减少，细胞膜表面出现皱缩，由此推断在高频信号下通过阻抗值区分斑马鱼不同的生长阶段是可行的。

图6 不同阶段斑马鱼形态

利用电化学工作站(上海辰华仪器有限公司，CHI650E)对胚胎细胞进行前期跟踪检测，采用交流阻抗法从100 kHz至1 MHz进行高频阻抗值检测，结果显示不同阶段的细胞在460 kHz频率之前阻抗值存在较大差异，阻抗值随频率变化趋势平稳，在460 kHz频率后细胞阻抗出现较大幅度的下降，说明细胞膜绝缘能力开始下降，电场线开始穿过胚胎细胞，阻抗值反映细胞内部信息。选取测得阻抗值最低点频率800 kHz进行后续检测。

利用本文所研制的硬件电路在800 kHz、2 Vpp的正弦激励信号下对20个胚胎细胞进行跟踪检测。如图7所示，处于stage1的斑马鱼胚胎细胞测得幅值均值为295.95 mV,处于stage2的斑马鱼胚胎细胞测得幅值均值为370.45 mV,处于stage3的斑马鱼胚胎细胞测得幅值均值为498.35 mV,检测结果表明，胚胎细胞在3个不同生长阶段检测到电压幅值具有明显差异，反映了3个生长阶段阻抗值之间的不同，可以借此反推其生长阶段。上述结果与电化学工作站测得规律相一致，证明了本检测系统的准确性和可靠性。

图7 斑马鱼胚胎细胞不同时期阻抗

5、结论

本文基于库尔特原理将细胞电学特性与力学特性相结合，设计并制作了细胞检测系统。以斑马鱼胚胎细胞为检测对象，设计了带有微收缩结构的微流控芯片和检测电极，并开发了软硬件检测单元。通过正压驱动斑马鱼胚胎细胞通过微收缩孔径，测量通道两端阻抗变化，通过记录电压信号幅值变化与穿越通道时间来表征其电学特性与力学特性。利用本文系统对斑马鱼胚胎细胞的体积、活性、生长阶段进行检测，发现在低频信号下，健康斑马鱼胚胎细胞具有绝缘特性，测得其通过收缩通道引起的电压幅值与时间变化主要取决于细胞体积大小；死亡斑马鱼胚胎细胞通过收缩通道的幅值变化非常微弱，证明了细胞膜的选择透过性与细胞活性有关；在高频信号下，斑马鱼胚胎细胞的3个不同生长阶段下测得电压幅值变化具有明显差异，未来可以借此反推其活性和生长阶段。上述检测结果与借助光学显微镜与电化学工作站的检测结果一致，证明了本文检测系统的准确性和可靠性。

参考文献:

[2]敬灵芝,范苏娜,姚响,等.基于微流控芯片构建复合力学刺激细胞反应器[J].传感器与微系统,2022,41(8):6-10.

[3]张孝哲,项楠,倪中华.单细胞机械性能检测方法与应用研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2022,49(2):303-317.

[8]唐文来.微流控单细胞电阻检测系统的开发与实验研究[D].南京:东南大学,2017.

[9]徐德洪,邓琪,姚佳烽.基于电阻抗成像的细胞检测传感器开发[J].传感器与微系统,2023,42(11):93-95.

[11]徐杰,孙向阳,于增辉,等.一种多通道微弱电流信号检测电路的设计与实现[J].电子制作,2021(5):9-11.

[12]周佩丽,张记龙,王志斌.光电离传感器中微电流检测电路的设计[J].传感器与微系统,2011,30(4):108-110.

[13]闫延鹏.基于超声生物效应的系统及动植物的早期发育应用初步研究[D].重庆:重庆理工大学,2021.

基金资助:重庆市教委科学技术研究资助项目(KJQN202001122); 重庆市技术创新与应用示范(社会民生类)一般项目(cstc2018jscx-msyb0290); 重庆理工大学研究生教育优质课程资助项目(yyk2017106);重庆理工大学实验技术开发基金资助项目(SK202309,SK202014);重庆理工大学研究生教育高质量发展行动计划资助项目(gzlal202304,gzlcx20232109);

文章来源:刘逸松,纪树泰,李浩正,等.基于库尔特原理的斑马鱼胚胎细胞检测系统[J].传感器与微系统,2024,43(11):156-159.